檢測人巨細胞病毒pp65基因的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及熒光探針PCR檢測人巨細胞病毒PP65基因 的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV)，屬于皰瘆病毒科β亞科，是一種 雙螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中廣泛傳播，在人體感染過程中，分為急性感 染和潛伏感染，一經感染，人體將終身攜帶。HCMV多以潛伏感染形式存在于人體多種細胞 中，在免疫系統功能正常的人體中，潛伏感染不致病，但HCMV感染在孕婦和嬰幼兒等免疫 功能低下的人群中，可導致包括致死在內的嚴重后果。妊娠期婦女由于其內分泌和免疫狀 態的改變可使體內潛伏的HCMV被激活，通過母嬰垂直傳播給胎兒，導致死胎、流產、胎兒發 育遲緩及多種機型。此外，自身免疫病患者、接受免疫抑制治療患者、以及接受化療、放療的 腫瘤或器官骨髓移植的患者等極易通過感染而發生HCMV急性感染，引起諸如HCMV肝炎、肺 炎、單核細胞增多癥等HCMV致病表現。如當骨髓移植，肝、腎、心臟等器官移植患者免疫功 能受損時，潛伏病毒被激活、增值而發生嚴重感染，將導致患者器官移植失敗甚至死亡。
[0003] 研究表明，一旦出現HCMV感染的臨床癥狀，抗病毒藥物不能控制該病的病理進 程，這意味著抗病毒藥物必須在HCMV感染的臨床癥狀出現前就使用，這就有賴于實驗室的 分析。
[0004] HCMV感染的常用檢測方法有病毒分離培養法和血清學方法。病毒分離培養法為 HCMV實驗室診斷的金標準，但培養所需時間過長，一般5-10天，結果受標本保存時間影響 大，且分離培養條件和技術要求高，不適合大范圍推廣作為臨床常規檢測。血清學主要檢測 HCMV-IgG和IgM，IgG陽性僅能提示人體曾感染HCMV，不能證明是否為HCMV急性感染；IgM 陽性表明存在急性感染，但針對免疫功能低下的患者，機體難以產生足夠量的IgM，因此存 在大量假陰性結果，且不能區分潛伏感染和活動性感染。抗原血癥檢測技術是一項快速、敏 感的診斷技術，但是傳統檢測方法多以白細胞為病毒抗原檢測載體，限制了其臨床應用。
[0005] PP65是HCMV病毒復制的早期蛋白，它出現于病毒感染的早期，在細胞感染后3-4 小時即開始出現，是HCMV病毒含量最豐富的蛋白。其功能是將病毒的DNA錨定在受感染細 胞的核膜上，在胞漿的高爾基體內合成，然后運回核內。隨著研究的深入，HCMV-PP65抗原 被認為是HCMV感染表達的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期預測HCMV病。申請號 為201310549511. 4的發明專利公開了一種應用免疫熒光技術檢測HCMV PP65抗原，利用與 PP65具有特異性的適配子，構建了一種磁珠-適配子-抗原-單克隆抗體復合體，提高了 PP65檢驗效率。申請號為201310549370. 6的發明專利公開了一種基于生物芯片快速檢測 PP65的方法，利用與PP65具有特異性的適配子，應用生物芯片技術檢測HCMVPP65抗原，提 高了 PP65檢驗效率。申請號為201410040889. 6的發明專利公開了一種檢測人巨細胞病毒 (HCMV) PP65抗原的ELISA方法，包括以下步驟：（1)制備檢測試劑盒：包被有大鼠抗重組 PP65322-561多克隆抗體（pAb)的酶標板、兔抗重組PP65322-561pAb、標準品、HRP-羊抗兔 IgG、PBST洗滌液、底物顯色液、終止液和封板膜；（2)制備待測標本；（3)檢測人巨細胞病 毒PP65抗原。
[0006] 核酸檢驗作為一種醫學檢驗技術已經在感染性病原體診斷中體現出了巨大的優 勢和作用。現有HCMV試劑盒大多檢測外周血，采集標本會造成創傷，且存在靈敏度低、穩定 性差等缺點。研發無創性、高靈敏度和高特異性的HCMV核酸檢測試劑盒對診斷HCMV感染 有著積極的意義。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法， 該方法操作簡單，具有無創性、靈敏度高和特異性高的優點，適用于臨床分子診斷。
[0008] 為實現上述目的，本發明的技術方案為： 一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法，所述的方法具體為： 從待測樣本中提取DNA，以所得DNA為模板，采用特異性引物對和熒光標記探針進行 PCR擴增，進行實時熒光探針PCR檢測；所述特異性引物對是序列如SEQ ID N0 :1所示的上 游引物PP65-F和序列如SEQ ID N0 :2所示的下游引物PP65-R ;所述熒光標記探針序列如 SEQ ID N0:3所示。熒光探針PCR檢測是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信 號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在本 發明中，設計了一條帶有FAM熒光素的熒光標記探針，其在PCR反應的退火期與PCR擴增的 目標互補單鏈DNA雜交，并被Taq DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性水解，水解后FAM熒光 素將遠離3'淬滅基團，從而在激發光作用下產生熒光信號。
[0009] 所述的一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法，所述的待測樣本為臨床尿液樣 本，以尿液樣本為待檢測樣本，實現了本發明的無創檢測。
[0010] 所述的一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法，所述PCR擴增的反應體系： 2. 5 XPCR buffer (已包含 Taq DNA 聚合酶)8ul，20 X Enhancer buffer lul，10uM 上游引物 PP65-F lul，10uM 下游引物 PP65-F lul，10uM 探針 PP65-P 0.5ul，模板 DNA 2ul，其余為無 核酸酶的滅菌高純雙蒸水，終體積為20ul。
[0011] 所述的一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法，所述PCR擴增程序為：（1) 50°C 處理2分鐘，95°C預變性2分鐘；（2)按照95°C變性15秒，55°C退火40秒為一個循環，共循 環40次。
[0012] 本發明的目的之二在于提供一種用于檢測人巨細胞病毒PP65基因的試劑盒，該 試劑盒對HCMVPP65基因進行PCR檢測，有很好的特異性和靈敏度。
[0013] 為實現上述目的，本發明的技術方案為： 用于檢測人巨細胞病毒PP65基因的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴增PP65基因的特 異性引物對，所述特異性引物對是序列如SEQ ID N0 :1所示的上游引物PP65-F和序列如 SEQ ID N0:2所示的下游引物PP65-R。利用特異性引物對可對待測樣本的DNA進行特異性 擴增。
[0014] 進一步，所述試劑盒還包括熒光標記探針，所述熒光標記探針序列如SEQ ID N0 :3 所示，該試劑盒對HCMV進行熒光探針PCR檢測，有很好的特異性和靈敏度。
[0015] 進一步，所述試劑盒還包括HCMV核酸標準品，所述的HCMV核酸標準品是將得到 的HCMVPP65基因序列連接到載體PBackZero-T vector上形成PBackZer〇-HCMVPP65質粒 即作為HCMV核酸標準品，利用標準品做成標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定 量分析。本發明中，HCMVPP65基因的序列是通過TA克隆連接到載體PBackZero-T vector 上進行克隆，得到PBackZer〇-HCMVPP65質粒。ΤΑ克隆技術（ΤΑ cloning)利用Taq聚合酶 具有末端轉移酶（TdT)活性，但卻不具有3' -5'端外切酶校準活性的特點，可在PCR產物的 3'端加上一個非模板依賴堿基"A"。pMD18-T是一種高效克隆PCR產物的專用載體，它是 由PUC18載體在Xba I和Sal I識別位點間插入一個EcoR V位點，然后用EcoR V進行酶 切使質粒線性化，并在它的3'端添加"T"構建而成。因其3'端帶有一個突出的"T"尾，能 高效地與帶"A"尾的PCR產物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產 物最簡便、快捷的方法。
[0016] 進一步，所述試劑盒還包括從待測樣本中提取DNA的DNA提取試劑，所述的DNA提 取試劑為本領域提取DNA常用的試劑。
[0017] 進一步，所述試劑盒還包括對提取的DNA進行特異性擴增的PCR擴增試劑，如PCR 緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs、DNA聚合酶等等。
[0018] 本發明的有益效果在于：（1)本發明的一種檢測人巨細胞病毒PP65基因的方法， 該方法操作簡單，具有無創性、靈敏度高和特異性高的優點，適用于臨床分子診斷。（2)本發 明的用于檢測人巨細胞病毒PP65基因的試劑盒對HCMVPP65基因進行PCR檢測，有很好的 特異性和靈敏度。
[0019]
【附圖說明】 圖1為標準品PCR熒光曲線圖； 圖2為樣本PCR熒光曲線圖。
[0020]
【具體實施方式】 所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但并不是本發明的內容僅限于所 舉實施例。所