系統性紅斑狼瘡生物標志物及其診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種系統性紅斑狼瘡外周血DNA甲基化標志物以及一種用于系統性 紅斑狼瘡的診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多器官、多系統受 累的自身免疫性疾病。臨床表現為腎臟、神經精神系統、血液系統等多器官受損。如果能夠 在SLE患者出現重要器官受累前進行早期診斷對于SLE的防治、改善患者的生活質量、提高 患者生存率具有重大意義。然而，目前的生物學診斷標志物大多是在器官受損后出現的生 化和免疫學改變，無法對SLE患者器官受累進行早期診斷。
[0003] 近年來，表觀遺傳學標記物研究發展迅速，許多表觀遺傳標志物如DNA甲基化標 記物、血清microRNA標記物被篩選和鑒定，這些標記物對于疾病的早期診斷和預后判斷具 有重要價值。已有大量文獻證實DNA低甲基化在SLE患者⑶4+T細胞異常活化及SLE發生 發展中發揮重要的作用。目前，已經鑒定的在SLE患者⑶4+Τ細胞中發生低甲基化的基因 包括⑶11a、⑶70、⑶40L和Perforin等。這些基因的低甲基化導致其過度表達，從而誘導 T細胞自身反應性活化，導致SLE發生。其中⑶11a和⑶70基因啟動子調控序列的甲基化 已經被證明可以用于SLE的輔助診斷。然而，這種方法限制在檢測外周血⑶4+T細胞基因組 中的CDlla和CD70基因甲基化水平。這就要求我們首先要收集較多的患者外周血樣本(約 20ml左右)，然后利用密度梯度離心法和免疫磁珠分選法分離外周血中的⑶4+T細胞。由于 抽取患者血液樣本較多，患者的醫從性較低；而且CD4+T細胞分選的實驗成本較高、實驗耗 時較長，增加了患者的負擔。另外，檢測CDlla和CD70基因甲基化以往采用克隆測序法、自 制芯片法，耗時較長，且無法給出一個精確的甲基化定量水平，給臨床上推廣應用帶來了困 難。
[0004] 目如臨床上尚無一種尚敏感性尚特異性的SLE診斷指標，即使是自身抗體如抗 ANA抗體，其對SLE的診斷敏感性為95%，但診斷特異性相對較低65%。為此，患者必須檢查 許多實驗室指標聯合輔助診斷SLE，導致疾病的診療成本大大增加，加重了患者的負擔。因 此，開發新的SLE診斷標志物十分必要，對提高SLE的診療水平具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于針對傳統的系統性紅斑狼瘡實驗室檢查指標靈敏度或特異性 不高的問題，克服現有技術方法的不足，提供一種新的高靈敏高特異性的SLE患者外周血 DNA甲基化標志物，并相應提供一種用于診斷SLE的靈敏度和特異性均較高的檢測試劑盒。
[0006] 發明人經過長期研究發現，發生于基因組上的表觀遺傳學修飾在SLE的發生、發 展中發揮重要作用，一些異常的DNA甲基化修飾可能作為SLE早期診斷的標志物。通過對 大樣本SLE患者、健康人、類風濕性關節炎患者外周血細胞中IFI44L基因轉錄起始位點上 游1500bp內的序列進行DNA甲基化檢測，證實其包含的兩個CG位點的甲基化水平分別在 SLE患者中較健康對照、類風濕性關節炎患者顯著降低，這兩個CG位點低甲基化用于診斷 SLE的靈敏度和特異性均很高。
[0007] 本發明所述一種高靈敏、高特異性的SLE患者外周血DNA甲基化標志物是人 IFI44L基因轉錄起始位點上游1500bp內的一段DNA序列，即位于人類基因組1號染色體 79,085, 190-79, 085, 311段(人類基因組數據hgl9版本)，其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 上述DNA序列包含兩個CG位點，其甲基化水平在SLE患者外周血細胞中較健康對 照顯著降低，與疾病對照類風濕性關節炎相比亦明顯降低。
[0009] 本發明還提出SEQ ID NO. 1所定義DNA序列的生物標記物在制備SLE診斷試劑中 的應用，該應用包括測定受試者外周血細胞中SEQ ID NO. 1所定義DNA序列包含的兩個CG 位點的甲基化水平。
[0010] 具體來說，可以通過PCR擴增目的DNA片段并測序后通過軟件分析測序結果來判 斷受試者外周血中的IFI44L基因轉錄起始位點上游1500bp內DNA序列的甲基化水平，包 括下述步驟：（1)抽提受試者外周血全基因組DNA ; (2)測定抽提的基因組DNA濃度；（3) 亞硫酸鹽處理基因組DNA ; (4)特異性PCR引物擴增待測DNA片段；（5)電泳檢測PCR產物； (6)對PCR產物進行測序；（7)分析測序結果，獲得待測序列中包含的兩個CG位點的甲基化 水平。
[0011] 本發明的另一目的還在于提供一種用于SLE診斷的試劑盒，該試劑盒包含SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的一組PCR引物以及如SEQ ID NO. 4所示的測序探針，以及任 意需要的試劑或介質，如外周血細胞基因組DNA抽提、DNA濃度測定、亞硫酸氫鹽處理、PCR 分析、電泳、焦磷酸測序分析。具體來說，所述試劑盒可以進一步包括一種或多種選自由以 下所組成的組中的成分：脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖劑、穩定劑、熱穩定DNA聚合酶和標記 物，包括熒光標記物、化學發光標記物和放射性標記物。
[0012] 本發明檢測SEQ ID NO. 1序列兩個CG位點的甲基化水平需要設計特異性PCR引 物擴增SEQ ID NO. 1所述DNA片段，引物設計是根據包含SEQ ID NO. 1所述目的DNA序 列及該段序列上下游200bp核苷酸的DNA序列設計，引物序列為：上游引物5' -TGTGGAT AGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3'（如 SEQ ID N0. 2 所示）；下游引物 5' -AACCTCATCCAATCTT AAAACACTTATA-3'（如SEQ ID N0. 3所示)，下游引物的5'端用生物素 biotin標記。本 發明用于焦磷酸測序檢測目的DNA片段中的CG位點甲基化水平需要特殊的探針，根據 IFI44L基因轉錄起始位點上游1500bp內的SEQ ID NO. 1所述序列設計測序探針，序列為： 5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG-3'（如 SEQ ID 勵.4所示）。
[0013] 本發明利用Illumina公司的DNA甲基化芯片（Illumina 450K)在國際上首次篩 選SLE患者外周全血細胞中差異DNA甲基化修飾基因。通過大規模臨床樣本篩查、利用最 新的遺傳學和表觀遺傳學檢測技術，尋找到SLE患者的早期診斷標記物，建立相應的檢測 方法，從而開發出SLE早期診斷試劑盒。通過與正常人外周血樣本相比，發明人發現IFI44L 是SLE患者外周血中DNA甲基化改變最顯著的基因之一。發明人通過擴大樣本也進一步證 實SLE患者外周血細胞中IFI44L基因起始位點上游1500bp內的一段序列DNA甲基化水平 較正常人和類風濕性關節炎（RA)患者顯著降低。IFI44L屬于I型干擾素通路，是一種干擾 素誘導基因。I型干擾素通路在SLE發病過程中起十分重要的作用。因此，IFI44L可以作 為SLE診斷的標志。
[0014] 本發明所提供的SLE診斷試劑盒克服了現有SLE檢測技術方法的不足，僅需要抽 取不超過lml的患者外周血，從SLE患者外周血中找到DNA甲基化標志物，因此顯著提高患 者的醫從性。本發明的試劑盒特異性和靈敏度高，檢查耗時短，操作簡單，需要的標本量少， 易于臨床上廣泛推廣，應用前景廣闊。利用焦磷酸測序儀配合特異性引物和探針可以大大 縮短DNA甲基化的檢查時間，大大了提高實驗室檢查的效率和檢查結果的準確性和特異性 (均可達到90%以上)。該項新技術和產品開發與應用將對于提高SLE的診治水平，提高SLE 患者的生存質量和生存率具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為特異性引物PCR擴增目的DNA片段（SEQ ID NO. 1)的電泳圖。
[0016] 圖2為CG位點1的甲基化在SLE患者、健康對照和RA患者中的差異。
[0017] 圖3為CG位點2的甲基化在SLE患者、健康對照和RA患者中的差異。
[0018] 圖4為CG位點1的甲基化水平用于SLE診斷的R0C曲線圖（與健康對照相比)。
[0019] 圖5為CG位點2的甲基化水平用于SLE診斷的R0C曲線圖（與健康對照相比)。
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