一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品安全領域，具體地，涉及一種同時檢測沙門氏菌（Salmonella)、志 賀氏菌（Shigella)和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus)三種菌株的方法。
【背景技術】
[0002] 食品中存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌導致的食源性疾病呈逐年上 升趨勢，給人們的健康帶來很大的潛在威脅。由沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌在全 球范圍內引發的食源性疾病導致大量人員死亡，造成數十億美元損失。一份2003-2007年 中國細菌性食源性疾病流行病學特征分析顯示，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門 氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的比例分別為10. 3%、8. 9%和1.5%，三種致病菌導致 的食源性疾病事件總數占到統計的1060起食源性疾病時間的20%以上。
[0003] 目前應對食品安全突發事件的手段一般為采集樣品后送到相關檢測機構進行傳 統分離培養，經生理生化實驗后進行確認或排除。此方法培養時間長、工作量大、實驗步驟 繁瑣，在很多突發事件中不能及時反映準確的數據。常規PCR方法檢測時間短，但其靈敏度 和可能帶來的污染是不能不考慮的問題。免疫磁分離技術是將特異性抗體與一定大小的磁 珠偶聯，利用特異性抗體能與細胞表面抗原相結合的原理，將磁球與細胞結合，在外磁場的 作用下，將磁球-細胞復合物從環境中分離出來，達到獲取目標細胞的一項技術，但是單獨 使用該技術時只能實現分離，還需結合其他手段進行檢測，而目前使用免疫磁分離技術進 行分離的檢測方法的靈敏度仍有待提高。Taqman探針法多重實時熒光定量PCR技術采用了 封閉式反應體系，采用多組特異性引物及探針，針對多組目標菌進行同時擴增檢測，而其準 確性仍有待提1?。
[0004] 目前應用免疫磁分離-多重熒光定量PCR對食品中的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃 色葡萄球菌進行三重檢測還未見有報道，值得進一步研究。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是克服現有檢測方法靈敏度和準確性不高以及難以實現三種菌株 的同時檢測的缺陷，提供一種具有高靈敏度和準確性并能夠同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌 和金黃色葡萄球菌的方法。
[0006] 為了實現上述目的，本發明的發明人進行了大量的研究，發現食品中的復雜成分、 培養基成分以及DNA提取過程中提取液的殘留成分等都是PCR反應的潛在抑制因子，會直 接影響檢測結果的準確性。進一步研究后發現，配合使用免疫磁分離技術與多重熒光定量 PCR的方法能夠有效地實現沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測。因此，本發 明提供了一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)將待測樣品與液體培養基混合，并將混合物置于能夠使待測樣品中可能存在 的細菌擴增的條件下進行培養，獲得擴增后的樣品；
[0008] (2)利用免疫磁珠捕獲擴增后的樣品中可能存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯得到；
[0009] (3)提取步驟⑴中捕獲的菌體的基因組DNA ;
[0010] (4)采用針對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物對提取到的基 因組DNA進行多重熒光定量PCR，根據多重熒光定量PCR的結果確定待測樣品中沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的存在。
[0011] 通過上述技術方案，本發明實現了沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的同時 檢測，靈敏度高且結果準確。而且，本發明方法能夠快捷地對待測樣品中的沙門氏菌、志 賀氏菌和金黃色葡萄球菌進行檢測，對提高快速應對食品安全突發事件的能力具有重大意 義。
[0012] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【具體實施方式】
[0013] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0014] 在本發明中，在未作相反說明的情況下，使用的單位"CFU/g"意指以每克待測樣品 為基準的菌株的CFU數；使用的術語"免疫磁珠"是指通過偶聯反應將抗體結合到磁性微 球（或磁球）的表面上，形成的免疫磁性微球；術語"PCR"是指聚合酶鏈式反應；術語"引 物"包括至少一個上游引物和至少一個下游引物；本發明中使用的液體體積均為20°C下的 數值。
[0015] 本發明提供了 一種檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的方法，該方法包 括以下步驟：
[0016] (1)將待測樣品與液體培養基混合，并將混合物置于能夠使待測樣品中可能存在 的細菌擴增的條件下進行培養，獲得擴增后的樣品；
[0017] (2)利用免疫磁珠捕獲擴增后的樣品中可能存在的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗體與磁球偶聯得到；
[0018] (3)提取步驟⑴中捕獲的菌體的基因組DNA ;
[0019] (4)采用針對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物對提取到的基 因組DNA進行多重熒光定量PCR，根據多重熒光定量PCR的結果確定待測樣品中沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的存在。
[0020] 根據本發明，為了準確地檢測待測樣品中三種菌株的存在，需要在免疫磁分離之 前對待測樣品進行細菌擴增處理，從而擴增待測樣品中可能存在的細菌，特別是沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌。所述液體培養基可以為本領域常規用于細菌培養的培養基， 如營養肉湯培養基（優選為加入有〇. 8-1. 2重量％的甘氨酸的營養肉湯培養基）。所述培 養的條件也可以為常規選擇，例如，培養的溫度可以為35-38°C，培養的時間可以為4-6h， 可以利用搖床進行所述培養，而搖床的轉速通常可以設置為100_200rpm。本發明中，經培養 步驟獲得的培養物即可直接作為擴增后的樣品。
[0021] 根據本發明，抗體與磁球偶聯獲得所述免疫磁珠的方法可以為常規方法，例 如，可以按照文獻（劉輝榮等，簡便高效分離細胞新型免疫磁珠制備，中國公共衛生， 2008,11:1349-1351)中的方法進行。
[0022] 為了捕獲待測樣品中的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌，所述抗體包括分 別能夠與沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌特異性結合的抗體，優選地，所述抗體包括 沙門氏菌多克隆抗體、志賀氏菌多克隆抗體和金黃色葡萄球菌多克隆抗體，更優選包括購 自Meridian公司的商品號（Cat. #)為G5V61-500的兔抗沙門氏菌抗體、購自Meridian公司 的商品號（Cat. #)為B65901R的兔抗志賀氏菌抗體和購自Meridian公司的商品號（Cat. #) 為B65881R的兔抗金黃色葡萄球菌抗體。
[0023] 所述磁球可以為各種常規用于免疫磁分離的磁球，例如，可以為表面修飾有氨基 或羧基的超順磁性Fe304聚苯乙烯復合微球。優選情況下，所述磁球的粒徑為150-200nm。
[0024] 優選情況下，相對于每毫克的磁球，所述抗體的用量彡0. lmg，更優選為0. 1-lmg。 在實際操作時，可以由不同抗體分別制得三種免疫磁珠，進行免疫磁分離捕獲時再將三者 加入體系中。
[0025] 優選情況下，相對于每毫升的擴增后的樣品，以磁球的重量計，所述免疫磁珠的用 量為0. 5-5 μ g，更優選為2-3 μ g。
[0026] 根據本發明，利用免疫磁珠捕獲三種菌體可以借助免疫磁分離系統（例如Matrix Pathatrix免疫磁分離系統）進行，對所述捕獲的條件沒有特別的限定，優選地，步驟（1) 中，捕獲的條件包括：溫度為35-38°C，時間為25-35min。
[0027] 根據本發明，對步驟（2)中提取基因組DNA的具體方法沒有特別的要求，可以為本 領域常規采用的提取DNA的方法，可以使用細菌基因組DNA提取試劑盒，具體操作及條件可 以參見試劑盒的說明書。
[0028] 根據本發明，所述多重熒光定量PCR為三重熒光定量PCR，所述特異性引物優選 為能夠特異地擴增沙門氏菌的NAa基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 :10所示）、志賀氏菌 的 ipaH 基因 （Accession Number :M76445)和金黃色葡萄球菌的 Sa442 基因 （Accession Number :AF〇33l9l)的引物。
[0029] 進一步優選地，多重熒光定量PCR所使用的上游引物、下游引物以及相應的特異 性熒光探針的核苷酸序列如下：
[0030] 上游引物 1 :5' -GCTATTTTCGTCCGGCATGA-3'（SEQ ID NO :1)
[0031] 下游引物 1 :5' -GCGACTATCAGGTTACCGTGGA-3'（SEQ ID NO :2)
[0032] 特異性熒光探針 1 :5' -TAGCCAGCGAGGTGAAAACGACAAAGG-3'（SEQ ID NO :7)
[0033] 上游引物 2 :5' -CTTGACCGCCTTTCCGATA-3'（SEQ ID NO :3)
[0034] 下游引物 2 :5' -AGCGAAAGACTGCTGTCGAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0035] 特異性熒光探針 2 :5' -AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3'（SEQ ID NO :8)
[0036] 上游引物 3 :5, -T