一種通過基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種通過基因阻斷提高鏈霉菌 的土霉素產量的方法。
【背景技術】
[0002] 鏈霉菌的生命周期很復雜，能夠產生多種次級代謝產物。這些天然產物為新藥的 發現提供了豐富的前體物資源。至1995年為止，由鏈霉菌中得到的具有抗生素活性的次級 代謝產物約有7000種。鏈霉菌產生的抗生素在醫藥和生命科學研究中得到廣泛應用。鏈 霉菌以其特有的發育分化特征和強大的次級代謝能力，在基礎研究與工業應用方面均具有 重要地位。抗生素的合成與大量調控因子相關，這些調控因子通過調控抗生素合成途徑中 的相關基因的表達量，調控了抗生素的產量。這為進一步利用這些調控因子作為靶點進行 基因改造，獲得抗生素商廣突變菌株，從而實現抗生素廣量的提商提供了肯能。
[0003] 龜裂鏈霉菌（Streptomyce rimosus)是土霉素（oxytetracycline，OTC)的商業化 生產菌株。土霉素屬于四環素類廣譜抗生素，能夠抑制對革蘭陽性菌、陰性菌、支原體、衣原 體、立克次體等引起的感染，同時也可用于治療梨形蟲病、附紅細胞體病。其作用機理是土 霉素能夠可逆性地與30S核糖體亞基結合，從而抑制氨酰tRNA核糖體復合體的形成，這樣 抑制了細菌的繁殖。因此研究人員不斷應用分子技術對S. rimosus進行研究，利用重組技 術改造菌株性能、提高抗生素產量，或者以此為骨架合成生產非天然新抗生素。然而，為了 提高土霉素的產量，本領域還有必要進一步研究提高土霉素產量的方法。
[0004] 鏈霉菌的次級代謝產物的生物合成基因常位于同一基因簇中，在基因簇中常包含 一個或多個途徑特異性調控基因，它們一般調控一種抗生素或幾種具有某些共同生物合成 途徑的抗生素的生物合成。抗生素生物合成基因簇的調控是受位于基因簇的轉錄調控子 (CSR)在轉錄水平上進行調控的，通常有單轉錄調控子調控和多轉錄調控子調控。
[0005] 但是，鑒于鏈霉菌的次級代謝調控網絡十分復雜，定位到對于土霉素產量確實有 調控作用的基因、且調節該基因的表達對于鏈霉菌自身生長不造成重大影響的基因仍然是 困難的。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種通過基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產量的方法。
[0007] 在本發明的第一方面，提供一種生產土霉素的方法，所述方法包括：
[0008] (1)在土霉素生產菌株中，下調IsigB基因（類sigB基因，like-sigB)的表達； [0009] (2)培養步驟（1)制備的菌株，從而生產土霉素。
[0010] 在一個優選例中，通過阻斷（較佳地為插入阻斷）或敲除IsigB基因，從而下調土 霉素生產菌株中IsigB基因的表達。
[0011] 在另一優選例中，在土霉素生產菌株中IsigB基因位置插入外源基因，從而阻斷 IsigB基因（較佳地，在該基因中第181-680位區間內插入外源基因）。
[0012] 在另一優選例中，所述的外源基因包括pKC1139質粒中的部分元件，例如ori T、 Ori pSG5、Apr〇
[0013] 在另一優選例中，所述的阻斷IsigB基因方法包括：提供表達載體，所述表達載體 中包含IsigB基因的部分序列（較佳地為第181-680位序列），將表達載體轉化龜裂鏈霉 菌，選擇基因組中整合有外源基因序列片段的重組龜裂鏈霉菌。
[0014] 在另一優選例中，所述的土霉素生產菌株是鏈霉菌。
[0015] 在另一優選例中，步驟（2)的培養方法包括：培養鏈霉菌孢子以形成菌絲細球，之 后接種至發酵培養基中，30±2°C (較佳地30土 1°C )，220±50rpm(較佳地220±20rpm)發 酵。
[0016] 在另一優選例中，所述的發酵培養基包括按照重量體積比：3%葡萄糖，1 %蛋白 胨，0.07% M0PS，0. 02%氯化鈣，0.02%硝酸鈉，0. 1%微量元素；其中，各組分的百分含量 可上下浮動10% ;較佳地浮動5%。
[0017] 在本發明的另一方面，提供一種改良的土霉素生產菌株，所述的菌株的基因組中 IsigB基因被阻斷或被敲除。
[0018] 在一個優選例中，以IsigB基因的部分序列片段作為同源臂，在土霉素生產菌株 中IsigB基因位置插入外源基因，從而獲得IsigB基因被阻斷或被敲除的菌株。
[0019] 在另一優選例中，所述的改良的土霉素生產菌株以鏈霉菌為出發菌株進行改良。
[0020] 在本發明的另一方面，提供IsigB基因的用途，用于作為改良土霉素生產菌株、提 高土霉素產量的靶點。
[0021] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0022] 圖1、土霉素的出峰時間。
[0023] 圖2、M4018: :lsigB突變株構建過程。
[0024] 圖3、擴增獲得IsigB部分片段及IsigB阻斷突變株M4018: : IsigB的驗證。
[0025] (A)PCR獲得IsigB的部分片段，Lanel、2均為得到的部分IsigB片段。
[0026] (B)pKB 質粒鑒定，Lanel :Xba I、BamH I 雙酶切 pKC1139 質粒，Lane2_4 :雙酶切驗 證pKB質粒。
[0027] (C)M4018::lsigB突變株PCR鑒定，其中，Lane 1 :以M4018基因組為模板，Lane 2 :pKC1139質粒作為模板，Lane 3-7 :以轉化子基因組為模板。
[0028] 圖4、單位菌體的土霉素產量柱狀圖。其中，縱坐標單位：0TC/DCW(mg/g)。
【具體實施方式】
[0029] 本發明人經過深入的研究，首次揭示在土霉素生產菌株中，下調（包括阻斷或敲 除）IsigB基因后，能夠顯著地提高土霉素生產菌株的土霉素產量。單位菌體的土霉素合成 量可提高20 %以上。本發明為土霉素生產菌株改造提供了 一個新途徑。
[0030] 如本文所用，"外源的"或"異源的"是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質 序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子 對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是"外源的"。
[0031] NCBI已公開了 IsigB基因序列及其編碼的蛋白序列，其氨基酸序列可參見 GenBank 登錄號：ELQ80095.1(SEQ ID N0:2)(Sig B/F/G subfamily RNA polymerase sigma-28 subunit),其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。因此，本領域人員易于獲得所述 基因。
[0032] 在土霉素生產菌株中下調IsigB基因可以采用多種本領域已知的方法，包括基因 沉默、基因阻斷、基因敲除、基因抑制等。這些方法均被包含在本發明中。
[0033] 例如，可以通過基于同源重組的基因插入阻斷技術來改造基因組中的IsigB基 因，從而使得IsigB基因被阻斷；也可以針對IsigB基因設計干擾性RNA或反義核苷酸來使 IsigB基因表達抑制或沉默。
[0034] 一種下調IsigB基因的方法是基因阻斷技術，在本發明的優選實施方式中，體外 構建IsigB基因阻斷質粒，通過同源重組的方法，在土霉素生產菌株染色體IsigB基因中 插入其他無關元件，從而使得染色體上的IsigB基因不再能夠編碼活性的蛋白質。當進行 基因阻斷時，無關元件的選擇是本領域技術人員易于選擇到的，例如應用一些抗性基因。 一種基因阻斷（敲除）的方法例如可參見Genetic Manipulation of Streptomyces:a Laboratory Manual中所記載的。較佳地，本發明實施例中，所述的無關元件包括pKC1139 質粒中的部分元件，例如ori T、0ri pSG5、Apr。此外，將IsigB基因進行缺失敲除，使之缺 少發揮功能的關鍵區域也是一種可行的下調基因的策略。
[0035] 在設計用于進行基因阻斷或敲除的構建物時，同時包含抗性篩選基因是優選的， 從而有利于后續篩選出發生基因被阻斷或敲除的菌株。
[0036] 基于本發明的新發現，本發明還提供了采用基因插入阻斷方法阻斷IsigB基因后 獲得的土霉素生產菌，該菌株不表達IsigB基因或表達量顯著性降低。本發明還涉及所述 菌株的用途，用于高產土霉素。
[0037] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0038] I.材料與方法
[0039] 1、質粒、菌株和培養基
[0040] 本發明中，所應用的質粒如表1所示。
[0041] 表1、質粒匯總
[0042]
[0043] 注：AmpR為氨芐青霉素抗性；AprR為阿普拉霉素抗性；KanR為卡那霉素抗性。
[0044] 表2、菌種匯總
[0046] pMD19-lsigB質粒的建立：以K-lsigBF、K-lsigBR為引物，以M4018基因組為模板 擴增IsigB擴增得到IsigB的部分片段，并引入BamHI和Xba I酶切位點，插入到pMD19 (大 連寶生生物有限公司）的BamHI和Xba I位點內，獲得pMD19-lsigB質粒。
[0047] 2、培養基配方
[0048] LB培養基（w/V):氯化鈉10%，蛋白胨10%，酵母粉5%，去離子水定容至1L后調 節pH至7. 0。固體培養基中加入2%瓊脂，121°C滅菌20min。
[0049] 麩皮培養基（w/V):麩皮6 %，瓊脂2 %。
[0050] TSB(Tryptone Soya Broth)培養基（w/V) :3% Tryptone Broth。
[0051] MS固體培養基（w/V) :2%黃豆餅粉，2%甘露醇，2%瓊脂。
[0052] Emerson 培養基（w/V) :0.4% 蛋白胨，0.4% Beef，0. 1%酵母粉，1%葡萄糖， 0· 25% NaCl，2%瓊脂。
[0053] 種子培養基（w/V) :1%葡萄糖，1.5%胰蛋白胨，0.05%酵母粉，0.28%蔗糖， 0. 01 %碳酸?丐。
[0054] 天然發酵培養基（￥八）：3%葡萄糖，1%蛋白胨，0.07%10?3,0.02%氯化 鈣，0.02 %硝酸鈉，0.1 %微量元素。其中微量元素（g/L):氯化鋅0.04,六水合氯化 鐵0.2,二水合氯化銅0.01，四水合氯化錳0.01，十水合硼酸鈉 0.01，四水合鑰酸銨 ((ΝΗ4)6 · Μο704)〇· 〇124〇
[0055] 3、試劑盒及工具酶
[0056] 分子克隆所用限制性內切酶均購自Takara生物技術（大連）有限公司。質粒抽 提試劑盒、膠回收試劑盒、片段純化試劑盒均購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。所用 引物見表3。
[0057] 表3、引物
[0059] 4、培養方法
[0060] (1)龜裂鏈霉菌M4018孢子懸浮液的制備
[0061] 用無菌棉簽蘸取活化后的孢子涂布于MS平板，30°C培養5-7