一種同時檢測對蝦hpv、mbv和ihhnv的多重pcr檢測引物、試劑盒及用圖
【專利說明】—種同時檢測對蝦HPV、MBV和丨HHNV的多重PCR檢測引物、
試劑盒及用途
技術領域
[0001]本發明涉及海洋生物病原檢測技術，具體涉及一種同時檢測對蝦肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)、斑節對4下桿狀病毒(Monodon baculovirus, MBV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infect1us hypodermal and hematopoietic necrosisvirus, I HHNV)的多重PCR檢測引物、試劑盒及用途。
【背景技術】
[0002]對4下肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)屬于細小病毒科，濃核病毒亞科，平均直徑22-23 nm，有包涵體，單鏈DNA病毒(ssDNA)，無包膜二十面體。其在病毒學中屬于慢性感染類型，傳染性強，發病率高。對蝦感染肝胰腺細小病毒后，肝胰腺上皮細胞腫大，變性，尤其在疾病充分發展期的病蝦肝胰腺、鰓組織，以及后胃和前中腸粘膜層細胞壞死解體，最后肝胰腺僅剩下一團結締組織，以至病蝦失去消化吸收功能，呼吸器官也遭到嚴重損害，造成窒息而死。
[0003]對蝦肝胰腺細小病毒是已知的導致對蝦生長緩慢的主要細小病毒之一。HPV已在世界各地的野生對蝦和養殖對蝦中被發現。其致病率高，分布廣，對對蝦養殖業可造成巨大的經濟損失。HPV很少單獨感染對蝦，多與其他多種病原性的病毒發生混合感染，并且在大多數情況下，重感染的對蝦卻沒有明顯的炎癥反應。致病蝦生長變緩、活動呆滯、食欲減退、較少蛻皮，蝦體表常有雜物附著；成蝦甲殼變軟，腹部肌肉變白，常并發二次性細菌感染，以弧菌較為常見。迄今為止，還沒有有效的預防措施可減少對蝦的感染。
[0004]斑節對4下桿狀病毒(Monodon baculovirus, MBV)又名草?!下桿狀病毒病(grassshrimp baculovirus )、因首次在斑節對4下(/fewaeiA?/wwoi/oi?)中發現而得名。1987-1988年MBV在臺灣等地區爆發流行，1991年在大陸發現。在中國、泰國、新加坡、印度尼西亞、馬來西亞均有廣泛分布。
[0005]斑節對蝦桿狀病毒屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬A亞群。病毒為桿狀，有囊膜，有包涵體，為雙鏈DNA病毒(dsDNA)。核衣殼大小為42X246 nm，連囊膜大小約為75X324 nm。不同種類的蝦所觀察到的病毒顆粒大小略有差異。斑節對蝦桿狀病毒感染部位是肝胰腺及前中腸的上皮細胞核，并在細胞核內產生多個嗜酸性的圓形或橢圓形的病毒包涵體。
[0006]致病蝦食欲減少，活動呆滯，鰓、附肢和體表常帶有大量的附生生物。受感染后幼體除部分體色加深外，并無特別癥狀，多數攜帶病毒的蝦活動正常。受感染幼體群常常無明顯的癥狀表現而出現大量死亡，更因繼發感染其它病毒、細菌或附生物而導致幼體大量死亡。
[0007]傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infect1ushypodermal and hematopoieticnecrosis virus,簡稱IHHNV)最初于1981年在美國夏威夷地區養殖細角濱對4下{Litopenaeus stylirostris)中被發現(Lightner et al，1983)。
[0008]傳染性皮下及造血組織壞死病毒是世界各地養殖和野生對蝦的重要病原之一，屬于細小病毒科{ParvoviridaS)短濃核癥病毒屬(Brevidensovirus')。是目前已知的對4下病毒中顆粒最小的一種，直徑22 nm，單鏈DNA細小病毒(ssDNA Parvovirus)無包膜，20面體對稱的球狀顆粒。IHHNV感染對蝦的部位，包括外胚層組織，如鰓、表皮、前后腸上皮細胞、神經索和神經節，以及中胚層器官，如造血組織、觸角腺、性腺、淋巴器官、結締組織和橫紋肌。在宿主細胞核內形成包涵體。患此病的病蝦身體變形，引起慢性感染為主。死亡率不高，但嚴重影響經濟效益。
[0009]IHHNV的敏感宿主是細角濱對4下(Litopenaeus stylirostris)和凡納濱對4下{Penaeus ，自然狀態下可感染大部分養殖對蝦，引起細角濱對蝦的發病和死亡，在凡納濱對4下，貝>J表現為慢性矮小殘缺綜合癥(runt-deformity syndrome, RDS)。同時也是南美白對蝦常見的一種慢性致病病毒。
[0010]在人工養殖中，對蝦可同時感染多種病毒。HPV和MBV在蝦類養殖業中經常出現混合感染，給對蝦養殖業及海洋資源的可持續發展帶來嚴重威脅。因此，對病毒進行檢測和監控就顯得意義非常重大。
[0011]目前，對蝦病毒病的診斷手段主要包括病理學和生物學方法、免疫診斷法，分子雜交及PCR。已建立的常規PCR技術，常是一次只能檢測一種樣本，比較費時間。而多重PCR技術是一種特殊的PCR方法，在一個反應體系中加入多對病毒特異性引物，能夠同時檢測多種病原體，從而縮短病毒檢測的周期，提高檢測效率。但多重PCR檢測也受多種因素的影響，比如DNA聚合酶的活性、模板的質量、所設計的病毒引物的特異性、PCR反應條件、不同病毒樣本間對試劑的競爭等因素都會影響檢測結果的敏感性和準確性。
[0012]基于當前現狀，需建立一種準確、快速、簡便的對蝦病毒檢測方法，以利于對病毒的早期診斷，便于及時采取有效的防治措施。
【發明內容】
[0013]本發明的目的在于提供一種方便快捷，檢測限低，且特異性強、靈敏度高、準確率高、且能同時檢測對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測方法。
[0014]為實現上述目的，本發明提供一種同時檢測對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分別為HPV-F 和 HPV-R、MBV-F 和 MBV-R、IHHNV-F 和 IHHNV-R，序列如 SEQ ID N0:1 和 2，SEQ IDNO:3 和 4，SEQ ID NO:5 和 6 所示。
[0015]一方面，本發明還提供一種用于同時檢測對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的引物對。
[0016]另一方面，提供所述多重PCR引物或所述多重PCR檢測試劑盒中的引物檢測對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的用途。
[0017]另一方面，提供多重PCR引物或所述多重PCR檢測試劑盒中的引物檢測對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒的方法。
[0018]進一步，步驟為， 提取DNA，
PCR檢測，采用權利要求1的多重PCR引物或權利要求2的多重PCR檢測試劑盒中的引物；陽性對照為SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的核酸序列混合作為模板，陰性對照為:不含有對蝦肝胰腺細小病毒、斑節對蝦桿狀病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒任一病毒的任意DNA核酸序列；
結果判定，
當檢測樣本和陽性對照的擴增條帶大小接近，為90-120bp時，結果為對蝦肝胰腺細小病毒陽性；如果沒有90-120bp條帶，則為對蝦肝胰腺細小病毒陰性；
當檢測樣本和陽性對照的擴增條帶大小接近，為180-220bp時，結果為斑節對蝦桿狀病毒陽性；如果沒有180-220bp條帶，則為斑節對蝦桿狀病毒陰性；
當檢測樣本和陽性對照的擴增條帶大小接近，為270-320bp時，結果為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽性；如果沒有270-320bp條帶，則為傳染性皮下及造血組織壞死病毒陰性；
當陰性對照出現條帶時，表明操作過程中有試劑污染，檢測結果無效；
當陽性對照無條帶時，表明引物或者試劑盒中相關試劑降解，引物或試劑盒失效。
[0019]進一步，所述PCR檢測的PCR反應體系為:25 μ L反應體系中包含有10倍濃度的含鎂離子的Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.5 μ L，各引物終濃度為0.4μ Μ，提取好待檢測的DNA模板1 μ L。
[0020]進一步，所述PCR檢測