一種提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物應用技術領域，具體涉及一種提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用。
【背景技術】
[0002]微生物絮凝劑是利用生物技術，從微生物體或其分泌物中富集、篩選、純化而獲得的一種安全、易生物降解的新型水處理絮凝劑，微生物絮凝劑作為一種天然的絮凝劑，它在確保應用安全性的前提下還具有光譜絮凝活性，這為其在與人體健康密切關系的給水排水處理、食品加工和發酵工業等方而提供了廣闊的應用前景。
[0003]隨著工業廢水的大量排放，水體污染日益加重，水環境問題引起了廣泛的關注。絮凝沉淀是目前國內外普遍采用的一種水處理方法。而絮凝劑是沉降水處理過程的核心，在其中起著至關重要的作用。由于微生物絮凝劑具有絮凝范圍廣泛、高效、無毒、無二次污染等優點，使得近年來對微生物絮凝劑的研究取得了很大的進步。但是于此同時，仍有缺乏理論指導、制備成本高、難于大規模生產等問題迫切需要解決。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的一些問題，本發明提供一種提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用，所述選育方法是利用等離子體誘變技術對高產微生物絮凝劑的類芽孢桿菌進行誘變育種，提高了其絮凝效率和絮凝劑產量。本發明采用的類芽孢桿菌型號為A9，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，建議分類命名為:類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，保藏編號為:CGMCC2040，保藏日期為:2007年5月11日，地址:中國.北京.朝陽區北辰西路1號院3號；本發明的技術方案如下:
一種提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法，按照以下工藝步驟進行:
(1)將類芽孢桿菌出發菌株接種到普通液體培養基中，活化20~32h;
(2)將活化的菌液離心，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000~150000cfu/ml 的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15~20uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統對其進行誘變；
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養基中，培養36~48h ；
(5)根據菌落形態大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發菌株形態相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養基中，培養20~32h，得到產糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉接到發酵液體培養基中，培養24~72h;離心，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量粗多糖重量，確定步驟(6)得到的為產糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(8)將步驟(6)的產糖量較高的類芽孢桿菌菌株接種于普通液體培養基中，重復步驟
(6)和(7)的過程5~8次，確定其產糖量的遺傳穩定性。
[0005]所述類芽孢桿菌出發菌株由從果樹根系土壤分離篩選純化獲得。
[0006]所述普通液體培養基的化學成分及濃度為:牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蒸饋水1L/L。
[0007]所述普通固體培養基的化學成分及濃度為:牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15.0-20.0 g/L，蒸餾水 1L/L。
[0008]所述發酵培養基的化學成分及濃度為:葡萄糖20.0g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，磷酸氫二鉀5.0g/L,七水硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉0.lg/L，脲0.5g/L，酵母膏0.5g/L，蒸饋水1L/L。
[0009]所述活化過程的條件為:溫度25~30°C，pH6.5-7.5，搖床轉速130~160r/min。
[0010]所述培養過程的條件為:溫度25~30°C，pH6.5-7.5。
[0011]所述離心過程的條件為:轉速8000~10000 r/min，時間10~30min。
[0012]所述誘變過程的條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發射源與樣品之間的高度為5_，工作氣體為氮氣，照射時間為105~110s。
[0013]所述發酵過程的條件為:溫度25~30°C，pH 7~8，搖床轉速130~160r/min。
[0014]所述一種提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法應用于粉煤灰廢水、水體中微藻的沉降處理；所述應用較佳地為對濃度為1~10 g/L、粉煤灰粒徑大小為0.050-0.150mm的粉煤灰廢水、富營養化水體和高效藻類塘中微藻的沉降處理，絮凝率達到85%以上；所述應用最佳地為對水中純培養的念珠藻或顫藻的沉降處理，絮凝率達到96%以上。
[0015]本發明的有益效果如下:
本發明方法利用等離子體誘變技術對高產微生物絮凝劑的類芽孢桿菌進行誘變育種，有效提高了類芽孢桿菌的絮凝效率和絮凝劑產量，不但能為微生物絮凝劑的理論研究提供參考，拓寬對生物絮凝劑組成及合成、純化等方面的認識領域，還能為微生物絮凝劑的產業化提供技術保證。此外，將本發明方法獲得的產糖量較高的類芽孢桿菌菌株應用于粉煤灰廢水、水體中微藻的沉降處理，對濃度為1~10 g/L，粉煤灰粒徑大小為0.050-0.150mm的粉煤灰廢水、富營養化水體和高效藻類塘中微藻的沉降處理效果較佳，絮凝率達到85%以上；對水中純培養的念珠藻或顫藻的沉降處理最佳，絮凝率達到96%以上。
【具體實施方式】
[0016]本發明實施采用的類芽孢桿菌型號為A9，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，建議分類命名為:類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，保藏編號為:CGMCC2040，保藏日期為:2007年5月11日，地址:中國.北京.朝陽區北辰西路1號院3號。該類芽孢桿菌由從果樹根系土壤分離篩選純化獲得。
[0017]本發明實施誘變過程采用的多功能等離子體誘變器型號為:MPMS_MANDELA。
[0018]本發明實施稀釋過程采用的震蕩器型號為:K133。
[0019]本發明實施離心過程采用的高速臺式離心機型號為:LG16_A。
[0020]本發明實施醇沉-冷凍干燥法采用的真空干燥箱型號為:D2F_6050。
[0021]本發明實施采用的高效藻類塘水來自沈陽市多家污水處理廠經二級處理后的生活污水。
[0022]本發明實施采用的富營養化水來自沈陽市不同區域的景觀水體。
[0023]實施例1
提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用于濃度為4g/L，粉煤灰粒徑為
0.050-0.074mm的粉煤灰廢水的沉降處理，按照以下工藝步驟進行:
(1)將類芽孢桿菌出發菌株接種到普通液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0，搖床轉速為140r/min的條件下活化20h ；
(2)將活化的菌液在轉速為8000r/min的條件下離心15min，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統對其進行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮氣，照射時間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養48h ;
(5)根據菌落形態大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發菌株形態相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養24h，得到產糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉接到發酵液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.0的條件下培養48h ;在轉速為8000r/min的條件下離心15min，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量產糖量較高菌株的粗多糖重量為
1.79mg/mL，比出發菌株高出14.7% ；
(8 )將步驟(6 )的產糖量較高的菌株接種于普通液體培養基中，重復步驟(6 )和(7 )的過程5次，最終所得菌株的粗多糖產量為1.79±0.02mg/mL，遺傳穩定性較好；
(9)將步驟(6)的產糖量較高的菌株用于4g/L粉煤灰廢水的沉降處理，絮凝率為86.19%，效果較佳。
[0024]實施例2
提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用于濃度為10g/L，粉煤灰粒徑為
0.074-0.150mm的粉煤灰廢水的沉降處理，按照以下工藝步驟進行:
(1)將類芽孢桿菌出發菌株接種到普通液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為6.55，搖床轉速為130r/min的條件下活化30h ；
(2)將活化的菌液在轉速為9000r/min的條件下離心lOmin，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液20uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統對其進行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮氣，照射時間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養48h ; (5)根據菌落形態大小，初步篩選出等離子體誘變平板上與出發菌株形態相似、菌落半徑較大的初篩菌株；
(6)將類芽孢桿菌初篩菌株接種于普通液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養24h，得到產糖量較高的類芽孢桿菌菌株；
(7)將步驟(6)的菌懸液以1%的接種量轉接到發酵液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為6.5的條件下培養32h ;在轉速為8000r/min的條件下離心15min，分離，保留上清液，利用醇沉-冷凍干燥法得到的粗多糖即為絮凝劑，稱量產糖量較高菌株的粗多糖重量為
1.79mg/mL，比出發菌株高出14.7% ；
(8 )將步驟(6 )的產糖量較高的菌株接種于普通液體培養基中，重復步驟(6 )和(7 )的過程6次，最終所得菌株的粗多糖產量為1.79±0.02mg/mL，遺傳穩定性較好；
(9)將步驟(6)的產糖量較高的菌株用于4g/L粉煤灰廢水的沉降處理，絮凝率為85.31%，效果較佳。
[0025]實施例3
提高類芽孢桿菌產糖量的選育方法及其應用于水中純培養念珠藻的沉降處理，按照以下工藝步驟進行:
(1)將類芽孢桿菌出發菌株接種到普通液體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.5，搖床轉速為160r/min的條件下活化24h ；
(2)將活化的菌液在轉速為8000r/min的條件下離心15min，棄去上清液，沉淀菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為100000cfu/ml的菌懸液；
(3 )取步驟(2 )的菌懸液15uL制成菌膜，利用多功能等離子體誘變系統對其進行誘變，誘變條件為:電源功率為300W，工作氣流為12L/min，等離子體發射源與樣品之間的高度為5mm，工作氣體為氮氣，照射時間為108s ;
(4)取誘變后的菌體加入無菌生理鹽水稀釋至lmL，取0.lmL均勻涂布于普通固體培養基中，在溫度為25~30°C，pH為7.5的條件下培養45h