一種高活力酸性蛋白酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶制劑制備技術領域，具體是一種高活力酸性蛋白酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]酸性蛋白酶是一類最適pH值為2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相對分子質量為30000—40000。酸性蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據其產生菌的不同，微生物蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔子菌酸性蛋白酶。根據作用方式可分為兩類:一類是與胃蛋白酶相似，主要產酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類是與凝乳酶相似，主要產酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應用于食品、醫藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業中。國外關于酸性蛋白酶的研究和生產從20世紀初就開始了。乞今為止，已發現不少微生物可以產生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突變株(A.niger var.microsporus)、根霉(Rhizopus sp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘紅酵母(Rhdotorula glutinis)、粟疫霉(Endothia parasitica)、血紅色陀螺孔菌(Trametessanguinca)、芽枝霉(Cladosporium sp.)等。1903年,德國科學家從動物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。1911年美國科學家從木瓜中提取木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白渾濁物。自1954年吉田首次發現黑曲霉可產生酸性蛋白酶以來，國內外開始對微生物發酵生產酸性蛋白酶進行了廣泛的研究。1964年國外科學家發現大孢子黑曲霉突變體能產生兩種不同的酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌產酸性蛋白酶，并對該酶進行了純化和結晶。1968年從微小毛霉發酵物中篩選出一種酸性蛋白酶，并對其進行了純化和酶學性質分析。1995年國外科學家對煙曲霉酸性蛋白酶的基因進行了克隆和測序。2001年又從假絲酵母中篩選出一種酸性蛋白酶菌株，并對該酶進行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前為止，國外科學家對酸性蛋白酶的結構和功能等已經進行了廣泛系統的研究。
[0003]微生物產酸性蛋白酶我國從上世紀60年代就開始研制，1970年上海工業微生物研究所首先從黑曲霉篩選一株3.350產酸性蛋白酶菌株，填補了我國酸性蛋白酶制劑的空白。但3.350酸性蛋白酶菌種發酵活力較低，生產工藝較繁雜。1977年中國科學院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉經誘變、篩選的537高產酸性蛋白酶菌種。近年來國內在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于選育產酶活力高、抗逆性好的菌種。目前用于酸性蛋白酶生產的菌種主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它們突變株。錢玉英等(1994年)用60Co γ射線誘變處理黑曲霉CPu菌株，獲得突變菌株6042，產酶活力比出發菌株提高近4倍。章劍林等(1995年)以黑曲霉為出發菌株，采用高溫、超劑量常規誘變方法，獲得了產耐高溫酸性白酶的菌株S3-15，其所產酸性蛋白酶最適pH值為2.5，最適溫度為50°C，90°C下恒溫4h的酶活比出發菌株高64.2%。黃遵錫等(1999年)以黑曲霉YM3019為出發菌株，經紫外線和亞硝基胍誘變處理，獲得高產酶菌株A-1-1，產酶活力約是原始出發菌株的4倍。李永泉等(1999年)，對宇佐美曲霉所產的酸性蛋白酶進行了發酵過程動力學研究。戚淑威等(2006年)對青霉產酸性蛋白酶的適宜條件和酶學性質進行了分析。謝必峰等(2007)采用硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分離純化了黑曲霉產酸性蛋白酶，并對其氨基酸組分進行了分析。王云(2008年)通過質譜指紋法對黑曲霉發酵液中所產蛋白進行了分析比對和鑒定酸性蛋白酶分子生物學方面的研究。
[0004]國內生產酸性蛋白酶的廠家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產。早期生產的微生物酸性蛋白酶，只是工業級的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過液體通風發酵，成熟發酵醪再經硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流(沸騰)干燥、粉碎、化驗、包裝制成工業級酸性蛋白酶。隨著現代超濾膜濃縮技術在酶制劑行業上的應用，近幾年生產了食品級酸性蛋白酶制劑。食品酸性蛋白酶發酵與工業級相同，只是后提取不同，成熟發酵醪進入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀再經板框壓濾機壓濾，濾清液經超濾膜濃縮器濃縮經化驗合格，加入防腐劑、穩定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑。
[0005]中國專利CN 102676395 A公開了一株宇佐美曲霉突變菌株及其在制備酸性蛋白酶中的應用，所述宇佐美曲霉突變菌株(Aspergillus sp.)M1223采用液體深層發酵，發酵液粗酶以酪蛋白為作用底物，該酶最適作用溫度為40°C，最適作用pH為3.0，最適作用條件下，酶活性達到5600U/ml。該酶分子量在45KD左右。中國專利CN 101948820 A公開了一種酸性蛋白酶及其制備方法，以黑曲霉(Aspergillus niger)保藏于CICC編號2238為產酶菌種，采用固體發酵工藝制備，發酵產酶能力> 47000u/g(以干曲計)，液體酶收率> 85%,固體酶收率彡80%，最適ρΗ2.5-3.5，穩定ρΗ2.5-6.0 ;最適作用溫度為40_50°C，溫度穩定性范圍為30°C?50°C。
[0006]綜上所述，無論酸性蛋白酶的制備方法如何，酸性蛋白酶酶活及其作用條件仍是本行業技術人員最為關注的問題之一，生產高活力酸性蛋白酶對推動酸性蛋白酶的工業化生產具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0007]本發明所解決的技術問題是以高產酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)CCTCC NO:M 2013601為出發菌株，并進行培養基優化和發酵工藝改進，經特定發酵條件下的液體深層發酵，制得一種酶活力高、耐受溫度較強、耐pH值較寬泛的酸性蛋白酶。
[0008]為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0009]一種高活力酸性蛋白酶制備方法包括如下步驟:
[0010]⑴菌種活化
[0011]將保存完好的宇佐美曲霉CCTCC N0:M2013601的斜面菌種接種于斜面培養基，31-32°C培養36-48h進行菌種活化，如此活化2_4次；
[0012]所述斜面培養基組成為:葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物5-10g，干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，蒸餾水1000mL，pH值5.8，121°C滅菌20min。
[0013]所述中草藥提取物的制備方法如下:
[0014]按重量份數計，稱取黃芪60-70份，當歸55-65份，黨參40_45份，甘草40_45份，魚腥草35-45份，神曲35-45份，金銀花25-35份，柴胡10-15份，黃芩10-15份；將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C _90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節pH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質量比為1:1.5，控制溫度至60°C _78°C保持3-4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣1-3倍重量的水，控制溫度85°C _95°C保持l_3h，然后降溫至25_35°C，過濾，得第二濾液；將第一濾液和第二濾液按照質量比2-3:1-2合并，濾液真空濃縮后冷凍干燥、粉碎即得中草藥提取物；
[0015]所述混合酶為葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質量比4:3:2:1均勻混入口 ο
[0016](2)液體種子擴大培養
[0017]①一級種子培養:將步驟(1)活化后斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培