一種利用重組大腸桿菌高效生產角蛋白酶的發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用重組大腸桿菌高效生產角蛋白酶的發酵方法，屬于發酵工程 領域。
【背景技術】
[0002] 角蛋白酶（Keratinase)為一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和 細菌等多種微生物產生。角蛋白酶在食品、醫藥、飼料、精化和制革等工業中廣泛應用，具有 嫩化肉類、生產高級營養品、免疫制劑和飼料添加劑以及美容、軟化皮革等作用，并可導致 瘋牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白（Prion)的降解。
[0003] 目前已經報道的角蛋白酶基因主要來自國外的一株地衣芽胞桿菌的kerA基因。 雖然角蛋白酶有著巨大的應用和研究價值，但是從野生菌發酵制備角蛋白酶產量低，活性 不穩定，大大降低了角蛋白酶的開發和運用。
【發明內容】
[0004] 本發明將來自嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll_l的角 蛋白酶進行分子改造，獲得一種新的高活性的角蛋白酶并對其基因序列在大腸桿菌中高效 分泌表達，然后通過一系列的培養優化，確定其在3L發酵罐中的最佳發酵培養基和發酵培 養策略，獲得角蛋白酶高產。這對角蛋白酶的規模化生產及推廣具有深遠的技術指導意義。
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種高活性角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 4 所示。
[0006] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發明的第二個目的是提供表達權利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或細胞 系。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)為宿主、 pET22b(+)為表達載體，表達SEQIDN0.4所示的角蛋白酶。
[0009] 在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶基因連接在pET22b(+)的Ncol和Xhol 位點之間。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述基因工程大腸桿菌的構建方法，具體方案如 下：
[0011] (1)根據來自嗜麥芽窄食單胞菌（S.maltophilia)BBEll-l的一種角蛋白酶的多 次分子改造獲得的一種活性較高突變體的基因，設計引物克隆獲得，或者通過化學合成獲 得基因；氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0012] (2)將該基因連入pET22b(+)質粒，雙酶切位點為Ncol和Xhol，得到重組表達載 體；
[0013] (3)將該重組表達載體轉化進入大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得具有高效分泌角蛋白 酶的重組大腸桿菌。
[0014] 本發明的第三個目的是提供一種高效生產角蛋白酶的方法。
[0015] 所述方法是以表達SEQ ID N0. 4所示的角蛋白酶的基因工程菌為生產菌株，在發 酵罐上采用溶氧偶聯的補料方式獲得高密度菌體并高效誘導產角蛋白酶。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)為宿主、 pET22b(+)為表達載體，表達氨基酸序列為SEQIDN0.4所示的角蛋白酶。
[0017] 在本發明的一種實施方式中，所述方法是將基因工程菌活化后接種至含有氨芐青 霉素的發酵罐基礎培養基中，通過溶氧值與補料偶聯的流加策略，于37°C培養至0D_ = 30,然后降溫至20°C培養并加入最終濃度0. 2mM的誘導劑IPTG誘導，發酵48h時離心獲得 上清酶液，即為粗酶液。
[0018] 在本發明的一種實施方式中，所述發酵罐基礎培養基含有glycerol 8g/L、 (NH4)2HP04 5g/L、K2HP04 3g/L、NaH2P04 · 12H20 7g/L、sodium citrate 3g/L、MgS04 1. 5g/ L、2mL 微量元素，pH 7. 2 ;微量元素，按 g/L 計，含有：FeS04 · 7H20 10 ;ZnS04 · 7H20 5. 25 ; CuS04 · 5H20 3 ；MnS04 · 4H20 0. 5 ；Na2B407 · 10H20 0. 23 ；CaCl2 2 ； (NH4)6M〇7024 0. 1 ；
[0019] 在本發明的一種實施方式中，所述溶氧值與補料偶聯是指補加流加培養基并控制 溶氧值不大于30且不小于10。
[0020] 在本發明的一種實施方式中，所述補料是流加培養基中含有甘油200g/L、酵母粉 5g/L、MgS04 10g/L。
[0021] 在本發明的一種實施方式中，所述方法在發酵罐的流加培養過程中，控制發酵液 pH 為 7. 0-7. 2。
[0022] 在本發明的一種實施方式中，所述發酵是在3L發酵罐上進行，3L發酵罐的發酵條 件：初始培養溫度37°C，接種量2%，攪拌速度400-800rpm，初始裝液量1L，通氣量lvvm。
[0023] 本發明還要求保護所述角蛋白酶和所述基因工程菌在食品、飼料、化工、制革或者 制備藥物方面的應用，尤其是在制備日化洗滌產品、在皮革領域或者在飼料消化中的應用。
[0024] 本發明的有益效果：
[0025] 本發明構建了一株可以高效分泌高活性角蛋白酶的重組大腸桿菌，并實現其在搖 瓶或者發酵罐中生產制備角蛋白酶。本發明的重組大腸桿菌發酵生產的角蛋白酶酶活可達 4500U/mL(發酵時間48h)。本發明的角蛋白酶制劑，在洗滌、紡織、飼料消化、醫藥等領域具 有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :原始角蛋白酶重組大腸桿菌和本發明角蛋白酶重組菌的搖瓶發酵對比。
[0027] 圖2 :大腸桿菌的恒速碳源補料法發酵生產角蛋白酶；
[0028] 圖3 :大腸桿菌的與D0值偶聯的變速補料法產角蛋白酶。
【具體實施方式】 [0029] 培養基：
[0030] (1)種子培養基（g/L):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 10,瓊脂20 (固體培養基）， 121°C滅菌15min，氨芐青霉素終濃度100yg/mL。
[0031] (2)發酵基礎培養基：glycerol 8g/L，（NH4)2HP04 5g/L，K2HP04 3g/L， NaH2P04· 12H20 7g/L，sodium citrate 3g/L，MgS04 1.5g/L，2mL 微量元素，氨節青霉素終 濃度 100 μ g/mL，pH 7. 2 ;微量元素（g/L) :FeS04 · 7H20 10 ;ZnS04 · 7H20 5. 25 ;CuS04 · 5H20 3 ;MnS04 · 4H20 0· 5 ;Na2B407 · 10H20 0· 23 ;CaCl2 2 ; (NH4)6Mo7024 0· 1。
[0032] (3)流加培養基是：甘油200g/L，酵母粉5g/L，MgS04 lOg/L ;
[0033] 角蛋白酶酶活測定方法：
[0034] (1)原理：角蛋白酶水解角蛋白底物，釋放出酪氨酸，通過酪氨酸與福林酚顯色， 在660nm下測定吸光度值。吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。
[0035] ⑵測定步驟：0. lmL經適當稀釋的酶液，加入0. lmL的1 % (w/v)可溶性角蛋白 底物（使用前和〇. lmol/L的pH9. 0的Gly-NaOH緩沖液混合），在50°C反應20min，每個反 應樣品中加入〇. 2mLTCA反應終止蛋白沉淀劑，搖勻后10, 000r/min離心5min，取0. 2mL上 清液加入lmL的4% (w/v)Na2C03，再加入0. 2mL上海生工公司購買的福林酸試劑（預先稀 釋3倍）在50°C下反應15分鐘。使用0. 5cm的石英比色杯測定清液在660nm處的吸光值。 空白對照是在加入底物之前已經加入同等體積的TCA終止酶活，其他步驟相同。酶活定義 為每毫升酶液每分鐘釋放出多少微克酪氨酸。
[0036] 實施例1高效分泌角蛋白酶能力的重組大腸桿菌的構建
[0037] (1)根據本實驗多次分子改造獲得的一種高活性角蛋白酶突變體的基因序列模 版SEQ ID N0. 1，或通過化學合成得到模版，進行PCR擴增。反應條件為：95°C預變性5min 后進入一下循環：98°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸7min 50s，30個循環；72°C延伸 lmin50s，然后再降溫到12°C得到最終反應液。使用的DNA擴增酶為TaKaRa公司的Primer STAR，使用配方參照產品說明書。
[0038] ⑵將擴增后的PCR產物和pET22b⑴質粒用Ncol和Xhol內切酶處理，得到粘性 末端的DNA序列，再使用DNA連接酶在16°C下連接過夜。
[0039] (3)將連接液直接進行轉化感受態大腸桿菌JM109,轉化產物涂布含100mg/