一種黑莓cad類基因及其對皮刺的改良應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種黑莓CAD類基因及其對皮刺的改良應用，屬于植物基因工程領 域。
【背景技術】
[0002] 黑莓（Blackberry)為薔薇科懸鉤子屬（沿/ZwsL.)植物，原產于歐洲和北美洲，是 近年來國內興起的第三代果樹小漿果果樹的重要成員之一，因其果實獨特的風味和豐富的 營養價值受到國內外市場的青睞。黑莓是典型的灌木類型樹種，它具有生態適應性較強、易 栽培、成林快、對條件要求較低、投入少而產出較早等特征，在種植的第二年即可開花結果， 是低山丘陵地區調整種植業結構高收益的經濟果類品種之一。作為懸鉤子類果樹，黑莓的 大多數品種有皮刺，遍布于枝條、葉柄及葉脈上，使得收獲和栽培管理十分不便。在果樹栽 培上無疑希望植株各個器官光滑無刺，目前國內外尚無在分子水平上對林木皮刺發生機理 進行系統研究的報道。
[0003] 國內黑莓育種工作近幾年才逐漸得到重視，進展較為緩慢，原因主要在于黑莓具 有復雜的遺傳背景，且存在雜交結實率及雜交種子出苗率均較低的問題。因而常規雜交育 種方法對已有黑莓品種進行種質改良有很大的局限性。隨著生物技術的不斷發展，植物基 因工程作為現代植物改良育種的有效手段，其中許多新的方法被運用于果樹育種中。若能 通過黑莓葉片外植體直接再生途徑實現內源基因在不同基因型中的遺傳轉化，將會為黑莓 育種提供便捷的轉基因途徑及其技術保障。木質素是植物體內一種重要的次生代謝物質， 主要廣泛存在于維管植物的機械組織、輸導組織和保護組織的細胞次生壁中，增強植物體 的機械強度，是植物細胞壁的骨架物質。植物體合成木質素單體及其聚合物是一系列酶 催化完成的生物化學反應，其中肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD， EC1. 1. 1. 195)作為限速酶控制木質素合成的特異途徑的最后一步反應，依賴輔酶NADPH 將3種肉桂醛(松柏醛、香豆醛、芥子醛）還原生成相應的3種肉桂醇(松柏醇、香豆醇、芥 子醇)，且研究已證明其活性與木質素含量和木質素單體的比例有關，可以通過降低或提高 CAD活性減少或增加木質素的合成。諸多研究表明CAD基因在木質素合成中發揮著極其重 要的調控作用，在不影響植物生長發育的前提下，利用CAD改變木質素的成分或者降低木 質素的含量已成為當前研究的熱點。本發明將克隆的一個黑莓沿/0/堪因構建植物表達載 體，通過農桿菌介導方法轉入多刺基因型品種中，通過分子和表型鑒定，獲得了少刺黑莓種 質。
【發明內容】
[0004] 1、本發明目的在于提供一種黑莓CAD類基因及其對皮刺的改良應用方法。
[0005] 2、為了實現上述目的，本發明采用的技術方案包括了以下5個步驟： (1) 黑莓內源基因 CAD的cDNA全長克隆及正義轉化載體構建； (2) 含有內源基因的農桿菌菌液制備； (3) 農桿菌侵染黑莓離體葉片及葉片再生； (4) 黑莓陽性再生植株中內源基因轉化子的鑒定。
[0006] (5)黑莓遺傳轉化株皮刺的表型鑒定。
[0007] 其中步驟（1)的具體方法如下： 1)參照Boysenberry轉錄組測序結果SEQ ID NO. 1設計沿cDNA全長特異性引物 CAD-F:5'- GTAggatccAAAATGGTGGCATCTGCAGAGC -3'，；CAD-R:5'- CGggatccGGAGCT GGCCT TCAATGTGTTT -3'。利用PCR法獲得擴增產物，擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收 擴增產物，并連接到pUM-Τ載體，轉化感受態大腸桿菌，置于LB固體平板(含100 mg/ L Amp)上篩選重組子。陽性重組子經質粒提取和PCR鑒定后測序。
[0008] 2)將含有目的基因沿柏載體和pBI121載體分別用及I酶切4 h，將酶切 后的載體片段和目的基因片段分別膠回收，之后利用T4連接酶連接，連接后載體轉化感受 態大腸桿菌，提取陽性重組子質粒，設計和合成35S啟動子和g印正反向引物，經目的 基因擴增及與35S啟動子和g印引物結合擴增，均能擴出預期條帶者為基因正向插入載體 pBI-35S-gfp:CAD 構建成功。
[0009] 3)利用凍融法將上述正義過表達載體pBI-35S-gfp:CAD轉入根癌農桿菌EHA105， 經含有Kan和Rif的YEB培養基篩選后，將轉化成功的菌經YEB液體培養基培養后提取質 粒，經PCR擴增驗證目的基因載體轉入農桿菌。
[0010] 步驟（2)的具體方法如下： 1)感染前3~4d，取保存的攜帶有過表達載體pBI-35S-gfp: CAD的EHA105農桿菌菌株， 在含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L固體YEB平板培養基上劃線培養活化，28°C恒溫培養 36-48 h〇
[0011] 2)挑取活化板上單菌落，接種于1 mL含Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L的液體YEB 培養基中，置于28°C恒溫搖床，180~200 rpm，培養24~36 h。至農桿菌生長至對數平臺期， 吸取50 μ L農桿菌培養液轉入50 mL新鮮的YEB液體培養基(含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L)中，置于28°C恒溫搖床，180~200 rpm，培養12~24 h，監測0D6。。值。
[0012] 3)取0D6。。值達到0. 5~1. 0的農桿菌菌液，轉移至50 mL無菌離心管中，4000~5000 rpm室溫離心5 min，棄上清液，收集菌體。用滅菌MS0液體培養基(含100 ymol/L AS)重 懸，稀釋至〇D6。。值0. 3~0. 5,作為侵染液備用。
[0013] 步驟（3)的具體方法如下： 1)取繼代培養30~40 d的黑莓試管苗中上部展開葉片，剪去葉尖和葉緣并保留2~3 mm 的葉柄作為外植體，正面向上接種于預培養培養基上進行預培養。預培養培養基中附加25 g/L的鹿糖和5. 6 g/L瓊脂，高壓滅菌前調pH至5. 8~6. 0。
[0014] 2)取步驟（2)中制備的菌液，將預培養的葉片置入其中浸泡7~10 min，吸去多余 附著菌液后接種于共培養培養基上培養3 d。
[0015] 3)將共培養后的葉片用無菌水沖洗后轉移至抑菌培養基上暗培養10 d。
[0016] 4)抑菌培養結束后將葉片用無菌水沖洗和濾紙吸干后轉移至選擇培養基上進行 抗性篩選，2~3周后無抗生素抗性的不定芽生長點白化和死亡，培養40 d后仍存活的為抗 性不定芽。
[0017] 5)將選擇培養基上的抗性不定芽切下，轉移至增殖培養基上繼續培養，每隔20 d 更換1次培養基，芽生長至2~3cm時置于生根培養基上誘導生根，最終形成抗性植株用于陽 性鑒定。
[0018] 步驟（4)的具體方法如下： 1)對于陽性植株，用沿目的基因引物、以及35S啟動子正向引物和沿目的基因 反向引物組合、#//基因引物不同類型擴增相結合進行PCR擴增，驗證所轉化的內源基因的 整合情況。
[0019] 2)在初步鑒定目的基因轉化成功的基礎上，根據基因序列設計特異性引物，采用 SYBR GREEN染料法，以植物保守的Tub為內參基因，使用熒光定量PCR儀（Roche公司)做 相對定量檢測，分析基因表達情況，表達量與對照有差異者初步判定轉化成功。
[0020] 步驟（5)的具體方法如下： 1)轉化植株的表型性狀鑒定：經PCR和熒光定量PCR鑒定陽性的植株生根后3周移栽 到穴盤中，精細管理。生長1個月后植株生長至10 cm高度時對轉化幼苗及其對照進行了 表型性狀調查，調查葉片數、株高、主莖粗度、主莖高度等，對主莖刺數、倒1葉至倒5葉葉柄 刺數和葉柄長進行調查，計算主莖刺密度、倒1葉至倒5葉葉柄刺密度。每個轉化株將所有 不定芽得到苗進行平均，對照品種調查5株取其平均。
[0021] 2)轉化植株CAD酶活性測定：CAD酶液提取和活性測定參照Goffner等（Planta， 1992,188(1) :48-53)在桉樹上的方法進行。移苗3個月后轉化植株長至約30 cm高度時， 分別取各轉化株和對照株頂端新生葉片以及2 cm莖尖0. 2 g左右樣品，在冰上用0. 1 Μ Tris-HCl緩沖液（ρΗ8. 8)(含1%PVP和1