一種長期儲存及復蘇培養成人外周血單個核細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種長期儲存及復蘇培養成人外周血單個核細胞的方法，尤其涉及一 種細胞凍存復蘇后高效擴增的方法，該方法可以進行成人免疫細胞的儲存及后期復蘇培養 應用臨床治療項目。
【背景技術】
[0002] 免疫細胞（immune cell)是白細胞的俗稱，包括淋巴細胞和各種吞噬細胞等，也特 指能識別抗原、產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分，在體 內分布很廣泛，主要是T淋巴細胞、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化（activation)，分裂增 殖、發生特異性免疫應答。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除T淋巴細胞和B淋巴細 胞外，還有一種淋巴細胞為自然殺傷細胞（natural killer cells，NK)。除淋巴細胞外，參 與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單核吞噬細胞系統的細 胞。
[0003] 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，即外周血中具 有單個核的細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞和其它少量細胞（造血干細胞等）。PBMC是將 白細胞進一步提取的、具有分化為更強大效應細胞的一部分。通過特定因子的誘導，PBMC 在體外可以分化為多種免疫細胞，如現在廣泛應用于生物治療的細胞因子誘導的殺傷細胞 (cytokine induced killer，CIK)，樹突狀細胞（dendritic cells，DCs)和自然殺傷細胞 (NK)等細胞。
[0004] 最新版的《世界癌癥報告》由世衛組織下屬的官方癌癥機構國際癌癥研究中心 (IARC)負責，來自40多個國家的250多位科學家參與編撰，對全球180多個國家的28種癌 癥的總體情況和流行趨勢進行了全面的描述和分析，這也是6年來首篇概述全球癌癥情況 的報告。
[0005] 報告預測全球癌癥病例將呈現迅猛增長態勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至 2025年的1900萬人，到2035年將達到2400萬人。
[0006] 報告還顯示，非洲、亞洲和中南美洲的發展中國家癌癥發病形勢最為嚴峻。2012年 全世界共新增1400萬癌癥病例并有820萬人死亡。其中，中國新增307萬癌癥患者并造成 約220萬人死亡，分別占全球總量的21. 9%和26. 8%。世衛的數據略低于中國自己的統計。 全國腫瘤登記中心發布的2012年數據顯示，中國每年新增癌癥病例約350萬，約有250萬 人因此死亡。
[0007] 細胞免疫治療有可能成為癌癥治療的主要手段。目前臨床試驗效果顯示，細胞免 疫治療在一些較難治療的癌癥病例中，取得較為突出的臨床效果和生存數據，是繼手術 和放療、化療后的一項突出有效的治療方式。目前該治療方式在國際上取得極大關注，如 2011年《Nature》雜志發表文章認為"癌癥細胞免疫治療即將迎來新一輪的研究高潮，未 來有可能在癌癥治療中占據相當重要的地位"；2012年底，《Science》雜志將癌癥免疫治 療列為2013年最值得關注的六大科學領域之一。科學界的關注，表明該治療方式的巨大 潛力，但也說明該方法目前還處于比較早期，在臨床試驗中研究較多，產業化需要逐步推 進。
[0008] 據了解，人的免疫力在20歲的時候達到巔峰，40歲時免疫力只有巔峰時的1/2,到 了 70歲更是只剩下巔峰時期的1/10,免疫力下降意味著免疫細胞對抗病毒、細菌以及癌變 的能力逐年降低，患病風險也相對提高。而在年輕、健康的情況下儲存優質免疫細胞，則是 給人體生命的一份保障，也是為人體健康儲存了一份希望。
【發明內容】
[0009] 本發明為了解決現有PBMC提取率較低、細胞凍存液含有動物血清、凍存細胞活率 低下及復蘇后細胞擴增能力不足等技術中存在的問題而提出的。
[0010] 本發明的一種長期儲存及復蘇培養成人外周血單個核細胞的方法，它是按照以下 步驟進彳丁的：
[0011] 一、對采集到的成人外周靜脈血進行分離純化，獲得外周血單個核細胞；
[0012] 二、對得到的外周血單個核細胞進行清洗，純化；
[0013] 三、用凍存液重懸外周血單個核細胞進行稀釋，使細胞懸液密度達到1~10X 107個/mL ;
[0014] 四、將稀釋后的細胞懸液分裝至1. 8mL凍存管中，每管添加 lmL，并留樣待檢，將細 胞凍存管放入4°C預溫的程序降溫盒中，轉移到-80°C冰箱暫時儲存；
[0015] 五、預留的凍存細胞懸液進行細菌、真菌、內毒素和支原體等指標的檢測，指標檢 測合格后，凍存入庫做長期保存；
[0016] 六、復蘇時，將從凍存入庫中取出的細胞轉入預溫至-80°C的凍存盒內后，平衡 5min轉入37°C水浴融化；
[0017] 七、將融化后的細胞轉移至含質量百分含量為10%人血白蛋白的生理鹽水混合液 中洗滌，檢測細胞活率，之后將細胞重懸于含有質量百分含量為10 %人血白蛋白的無血清 培養體系中接種培養，即完成所述的長期儲存成人外周血單個核細胞。
[0018] 本發明包含以下有益效果：
[0019] 本發明有別于其他儲存免疫細胞方式，是以細胞純化及濃縮為手段，可將抽取的 血液中免疫細胞保留比例提高至傳統方法的2到3倍，細胞復蘇存活率高達95%以上，同 時凍存細胞收率在95%以上（凍存后與凍存前細胞計數比值），本發明的方法一次可凍存 超過15億個種類完整的免疫細胞，包含樹突狀細胞、自然殺傷（NK)細胞及T細胞等，可有 效應用于多種免疫細胞療法并可供多次治療使用。正常情況下，免疫細胞保存期為20年左 右。目前國際上通用的免疫細胞保存技術是將獲得的免疫細胞儲存在_196°C深低溫狀態， 醫學研究與臨床實踐證明保存一百年以上的細胞仍然具有其生物活性。在免疫細胞保存期 間，可根據客戶要求進行定期復蘇、擴增，滿足客戶長期存儲的需求的同時還可以用于客戶 指定的免疫細胞治療等服務。同時，由于儲存及后期復蘇培養過程中沒有任何動物源血清 或蛋白的添加，保障了臨床應用的安全性及穩定性，大大降低應用后的副反應發生情況。
【附圖說明】
[0020] 圖1為成人PBMC提取效率圖；
[0021 ] 圖2為成人PBMC復蘇活率圖；
[0022] 圖3為CIK誘導培養擴增倍數圖；
[0023] 圖4為成人PBMC凍存后復蘇回收率圖。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0024] 一：本實施方式的一種長期儲存及復蘇培養成人外周血單個核細胞 的方法，它是按照以下步驟進行的：
[0025] -、對采集到的成人外周靜脈血進行分離純化，獲得外周血單個核細胞；
[0026] 二、對得到的外周血單個核細胞進行清洗，純化；
[0027] 三、用凍存液重懸外周血單個核細胞進行稀釋，使細胞懸液密度達到1~10X 107個/mL ;
[0028] 四、將稀釋后的細胞懸液分裝至1. 8mL凍存管中，每管添加 lmL，并留樣待檢，將細 胞凍存管放入4°C預溫的程序降溫盒中，轉移到_80°C冰箱暫時儲存；
[0029] 五、預留的凍存細胞懸液進行細菌、真菌、內毒素和支原體等指標的檢測，指標檢 測合格后，凍存入庫做長期保存；
[0030] 六、復蘇時，將從凍存入庫中取出的細胞轉入預溫至-80°C的凍存盒內后，平衡 5min轉入37°C水浴融化；
[0031] 七、將融化后的細胞轉移至含質量百分含量為10%人血白蛋白的生理鹽水混合液 中洗滌，檢測細胞活率，之后將細胞重懸于含有質量百分含量為10 %人血白蛋白的無血清 培養體系中接種培養，即完成所述的長期儲存成人外周血單個核細胞。
[0032] 本實施方式有別于其他儲存免疫細胞方式，是以細胞純化及濃縮為手段，可將抽 取的血液中免疫細胞保留比例提高至傳統方法的2到3倍，細胞復蘇存活率高達95%以上， 同時凍存細胞收率在95%以上（凍存后與凍存前細胞計數比值），本實施方式的方法一次 可凍存超過15億個種類完整的免疫細胞，包含樹突狀細胞、自然殺傷（NK)細胞及T細胞 等，可有效應用于多種免疫細胞療法并可供多次治療使用，是業界儲存免疫細胞種類最多、 數量最完整的細胞儲存技術。正常情況下，免疫細胞保存期為20年左右。目前國際上通用 的免疫細胞保存技術是將獲得的免疫細胞儲存在_196°C深低溫狀態，醫學研究與臨床實踐 證明保存一百年以上的細胞仍然具有其生物活性。在免疫細胞保存期間，可根據客戶要求 進行定期復蘇、擴增，滿足客戶長期存儲的需求的同時還可以用于客戶指定的免疫細胞治 療等服務。
【具體實施方式】 [0033] 二：本實施方式與一不同的是：步驟一中獲得外周 血單個核細胞的方法為：離心收集成人外周靜脈血，并水浴滅活，離心收集血漿上清液，每 10mL分裝一支，-80°C保存，備用；采用淋巴細胞分離液分離血細胞中的單個核細胞，并收 集單個核細胞。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0034] 三：本實施方式與一不同的是：步驟二中對得到的外 周血單個核細胞進行清洗，純化的具體操作如下：用復方電解質溶液洗滌單個核細胞兩次， 收集最后一次洗滌的上清液，并進行細菌、真菌、支原體和內毒素檢測，檢測合格后，離心收 集的細胞待用。其它與一相同。
[0035]
【具體實施方式】四：本實施方式與【具體實施方式】一不同的是：步驟三中的凍存液配 制如下：按細胞無血清培養基、人血白蛋白和DMSO的體積比為4:5:1的比例混合而成。其 它與【具體實施方式】一相同。
【具體實施方式】 [0036] 五：本實施方式與一不同的是：凍存液中的人血白蛋 白的質量分數至少為10%。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0037] 六：本實施方式與一不同的是：步驟五中指標檢測合 格是指：細菌、真菌、支原體檢測皆為陰性，內毒素含量不高于0. 25EU/mL。其它與具體實施 方式一相同。
【具體實施方式】 [0038] 七：本實施方式與一不同的是：該方法所用試劑為藥 用或GMP級別。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0039] 八：本實施方式與一不同的是：步驟七中無血清培 養體系中含有單克隆抗體和細胞因子；其中，單克隆抗體的在無血清培養體系中的濃度為 500ng/mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0040] 九：本實施方式與一不同的是：細胞因子為濃度20~ 100ng/ml GM-CSF、0. 5 ~4ng/ml IL-1α、1〇〇〇 ~4000IU/ml IL-2、5 ~30ng/ml IL-4、 0.25 ~2ng/ml IL-7、0.2 ~2ng/ml IL-12、0.25 ~2ng/ml I