一種農業根結線蟲復合生防菌劑的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種農業根結線蟲復合生防菌劑的制備方法，及其在農業根結線蟲生 物防治中的應用，屬于農業微生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 植物病蟲害是造成農作物減產的重要原因，每年因病蟲害減產的損失巨大，其種 植者為減少病蟲害的發生而使用大量化學農藥，進而造成病源生物對化學藥物的抗藥性增 加，形成惡性循環。與此同時，大量使用化學農藥造成農作物的品質下降，很多人談食色變。 在此背景下，高效低毒的生物農藥逐漸受到廣大農民、生產企業及政府的重視，發展有機種 植業大勢所趨，生物農藥存在巨大的市場空間。
[0003] 植物線蟲病是農作物、蔬菜、果樹、林木、花卉及藥材種植的四大病源生物之一，每 年造成世界農業生產的損失約1000億美元，全球農業上最重要的危害線蟲是根結線蟲和 胞囊線蟲，我國較為嚴重的線蟲有根結線蟲、大豆胞囊線蟲、小麥粒線蟲、甘薯莖線蟲、水稻 干尖線蟲、栗線蟲、松材線蟲等，僅我國農作物種植業線蟲病損失就達600億元。
[0004] 淡紫擬青霉能廣泛寄生于線蟲卵，殺蟲效果高效，被認為是最具有應用前景的根 結線蟲生防真菌，該菌具有功效高、寄生廣、易培養等特點，特別是在控制植物病源線蟲方 面功效顯著。淡紫擬青霉除了具有殺線蟲效果外，還可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘 翅目及鱗翅目等昆蟲，另外對植物病原菌(如玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花 枯萎病和水稻惡苗病等)具有拮抗作用。淡紫擬青霉的次級代謝物也有一定的生理效能，如 產生類似吲哚乙酸產物，促進植物根系和植株生長，對種子萌發和生長具有促進作用，還能 產生多種功能酶，并具有一定的化學農藥降解效應。
[0005] 淡紫擬青霉作為一種生物制劑，在殺線蟲過程中具有安全、高效、持效期長等特 點，其殺線蟲的活性并不比化學殺線蟲劑差，并有促進植物生長的作用。目前研究資料表 明，淡紫擬青霉菌劑可用于玉米等十幾種經濟作物、茄子等多種蔬菜、菊花等大量花卉藥材 及葡萄等多種果樹線蟲病的預防和治療。淡紫擬青霉菌劑與進口的化學殺蟲劑相比，殺線 蟲效果相當或接近，而其生產成本較低且有后效，并具有不污染農產品和環境的優點。淡紫 擬青霉類環境友好的殺蟲菌劑的研發成功對于我國的食品與農作物安全、農業的可持續 發展均具有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明針對上述技術背景及其存在的不足，提供一種農業根結線蟲復合生防菌 劑的制備方法，及其在農作物根結線蟲生物防治中的應用。以淡紫擬青霉YT08 CGMCC No. 10026為出發菌株，經固態發酵的方法生產農業根結線蟲復合生防菌劑，在培養過程中 添加殼聚糖和蟹殼粉等多種誘導因子，激活該菌株的根結線蟲侵染因子的生成量，通過多 生防功能因子聯合協同作用，提高根結線蟲的防治效果。
[0007] 本發明的目的可以通過如下措施來達到： 1. 一株具有防治番茄與葡萄根結線蟲病害的淡紫擬青霉，該菌株具有高產殼聚糖 酶的特性，其保藏名稱為：YT08,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏日期：2014年11月26日，保藏號為CGMCC No. 10026,分類命名：淡紫擬青霉 iPaecilomyces lilacinus、。
[0008] 2.菌種活化 從試管斜面保藏菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28~30°C、200 rpm下培養 36~48 h至菌體渾濁，制得活化種子液；所述的活化培養基（g/L):蛋白胨5~10,酵母粉 3~5,甘油20~25,粉末殼聚糖1~2,磷酸二氫鉀2~3,硫酸鎂2~3，磷酸氫二鈉2~ 3, pH 6. 5〇
[0009] 3.固態發酵 固體發酵培養基：干啤酒糟17~30%，麩皮4~8%，花生殼粉碎物3~6%，大豆蛋白胨 2~5%，粉末殼聚糖（90%以上的脫乙酰度）2. 55~7. 5%，蟹殼粉1~2. 25%，NaCl 0. 2~ 0· 5%，CaCl2 0· 1 ~0· 3%，MgS04 0· 1 ~0· 3%，FeS04 0· 05 ~0· 15%，含水量為 40 ~70%。配 制方法：先用水將NaCl、CaCl2、MgS04、FeS04、MnS0 4和大豆蛋白胨溶解，攪拌均勾，再與其他 物質混勻，pH自然。將上述固體發酵培養基裝入固體發酵容器中，121°C下蒸汽滅菌15~ 25分鐘。
[0010] 按照5~10% (體積百分比）接種量，將淡紫擬青霉YT08的活化種子液倒入固體 發酵培養基中，機械攪拌使菌種與發酵培養基混勾。在30~32°C下靜態培養，每隔3~5h 時通入無菌空氣1次。培養3~5d后至培養基表層長滿菌絲，再次機械攪拌將培養基料搗 碎混勻，在28~30°C下靜態培養，每隔5~8小時通入無菌空氣1次，繼續培養3~4d后 至培養基上長滿淡紫色孢子后終止發酵。
[0011] 4.產品成型 發酵終止后通過機械攪拌使培養物打散混勻，置于陰涼通風處晾干，然后用粉碎機粉 碎，即得淡紫擬青霉YT08的農業根結線蟲復合生防菌劑。制備的農業根結線蟲復合生防菌 劑經平板培養法確定其活菌數，高效液相色譜法測定其殼寡糖含量。
[0012] 所用的活菌數測定方法：稱取lg農業根結線蟲復合生防菌劑，加到含有50mL無菌 水的三角燒瓶中，在旋轉搖床中振搖l〇min使其充分混勻，然后吸取lmL樣液稀釋到適當梯 度。取0. lmL稀釋的樣液均勻涂布于孟加拉紅(虎紅)顯色培養基中，在28°C的恒溫培養箱 中培養3d至長出單菌落，計數菌落個數并換算為單位質量的農業根結線蟲復合生防菌劑 的總活菌數。
[0013] 所用的殼寡糖含量的測定方法：采用高效液相色譜儀測定，HYPERSIL HS APS 柱，洗脫液為乙腈：雙蒸水=3:2,流速0.8 mL/ min，柱溫40°C，水解產物0.05 %，上樣量 2〇μL，不同聚合度的殼寡糖及氨基葡萄糖單體作為標準對照品。
[0014] 本
【發明內容】
的有益效果在于： 1.淡紫擬青霉ΥΤ08 CGMCC No. 10026是一株對農作物根結線蟲具有強防治效果的 絲狀真菌，在其固體發酵培養過程中產生大量的殼聚糖酶及部分的幾丁質酶等水解蛋白酶 類，作為侵染因子進入根結線蟲內部，起到殺滅根結線蟲的效果。
[0015] 2.利用淡紫擬青霉YT08高產殼聚糖酶的特性，在菌體發酵過程中添加粉末殼聚 糖誘導產生殼聚糖酶，同時生成的殼聚糖酶又將培養基中殼聚糖降解轉化為高生理活性 的低分子量殼寡糖，其對根結線蟲有一定的抑制效應，也對多種植物病原蟲菌具有抑制作 用，。
[0016] 3.發酵培養基中中添加的粉末殼聚糖和蟹殼粉，除一部分轉化為殼寡糖外，還有 部分未降解的殼聚糖、幾丁質作為根結線蟲生物防治的輔助因子，另外其還可以抑制多種 植物病原菌，與菌體孢子一起形成對根結線蟲生物防治的協同效應。
[0017] 4.淡紫擬青霉YT08在發酵過程中還會產生許多的次生代謝產物，其可以促進農 作物生長且對根結線蟲及植物病原菌的抑制具有一定的增效作用，這些組分與生成的殼寡 糖以及淡紫擬青霉菌體孢子形成協同效應，提高其對根結線蟲的防治效果。
[0018] 本發明的突出優勢在于： 1.以啤酒糟、麩皮、花生殼等這些工農業有機廢棄物為培養基主要基料，發酵過程中 使用的原料成本較低，產品的市場競爭力明顯。
[0019] 2.相對液態發酵來說，固態發酵培養容易，操作方法簡單高效，對從業技術人員 的要求不高，且由于淡紫擬青霉YT08對多數病原菌具有抑制作用使其培養過程中不易染 菌。
[0020] 3.本發明中的農業根結線蟲復合生防菌劑中以淡紫擬青霉YT08作為殺滅根結 線蟲的主要功能組分，培養過程中產生的殼寡糖、殼聚糖酶、幾丁質酶以及其它眾多的次生 代謝產物也對根結線蟲具有一定抑制作用，從而具有協同防治的效果。
[0021] 4.本發明中的農業根結線蟲復合生防菌劑除了具有殺滅根結線蟲的作用外，還 能促進作物生長，抑制植物病原菌，增強作物根系的健康。
【具體實施方式】
[0022] 以下結合具體實施例對本發明做進一步詳細描述，這些實施例用于理解而不是限 制本發明的保護范圍。
[0023] 實施例1淺盤培養制備農業根結線蟲復合生防菌劑 從試管斜面保藏菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在30°C、200 rpm下培養36h至 菌體渾濁，制得活化種子液；所述的活化培養基（g/L):蛋白胨10,酵母粉5,甘油25,粉末殼 聚糖2,磷酸二氫鉀3,硫酸鎂3，磷酸氫二鈉3, pH 6. 5。
[0024] 采用的固體發酵培養基：干啤酒糟30%，麩皮8%，花生殼粉碎物6%，大豆蛋白胨 5%，粉末殼聚糖（90%以上的脫乙酰度）7. 5%，蟹殼粉2. 25%，NaCl 0. 5%，CaCl2 0. 3%，MgS040. 3%，FeS04 0. 15%，按照培養基組分總質量換算添加純凈水至含水量為40%。配制方法：先 用水將NaCl、CaCl2、MgS04、FeS04、MnS0 4和大豆蛋白胨溶解，攪拌均勾，再與其他物質混勻， pH自然。將上述固體發酵培養基裝入固體發酵容器中，121°C下蒸汽滅菌15分鐘。
[0025] 按照10% (體積百分比）接種量，將淡紫擬青霉YT08的種子活化液倒入固體發酵 培養基中，通過攪拌使菌種與發酵培養基混勻，放置于霉菌培養箱中培養，表層用事先滅菌 的8層紗布覆蓋，在32°C下靜態培養，每隔5h時通入無菌空氣1次。培養4d后至培養基 表層長滿菌絲，然后將培養基物料和菌絲體再次攪拌混勻，在30°C下靜態