一種內生真菌菌株nyn8c05及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物及微生物應用領域，尤其涉及一種內生真菌菌株NYN8C05,其在 降低煙草吸收重金屬方面的用途。
【背景技術】
[0002] 我國是全球最大的煙草生產國和消費國，吸煙人口超過3. 2億人。煙葉中的重金 屬主要來自于土壤，煙草生長過程中，根系不斷地從土壤中吸收重金屬，傳輸至莖和葉片 中，并逐漸累積（楊欣等，2010)。在抽吸過程中，煙葉中的重金屬元素以氣溶膠的形式進 入呼吸道，被人體吸收，而重金屬從人體內排出非常緩慢，因此會在人體內造成累積，，每年 有上百萬人死于相關疾病（Ronco et al.，2005)。近年來，由于大量的工業重金屬廢棄物 排入土壤和水生生態環境，重金屬污染問題日趨突出，2010年國際煙草控制政策評估項目 (ITC)組織公布的科研報告顯示，13個中國國產卷煙品牌檢測出含有Pb、Cd、Cr等重金屬， 其含量與加拿大產香煙相比，最高超出3倍以上。吸煙與健康成為國內外廣泛關注的熱點 問題，降低煙草制品有害成分是煙草行業科技發展的焦點。煙葉和煙氣中的重金屬是最重 要的有害成分之一，另外煙草病害也嚴重影響煙草產量和烤煙品質。而煙草農業對煙葉有 害成分和煙葉品質具有重要影響，利用農業生物技術進行調控，盡量減少煙葉有害成分的 本底含量，以達到降低煙草制品對人類健康危害的目的。
[0003] 煙草中含有多種重金屬元素，如砷、鎘、鉛、汞等，在抽吸過程中，這些重金屬可通 過主流煙氣進入人體，對人體造成潛在的危害。煙草是對鎘轉移能力極強的作物，煙草中鎘 含量比其生長的土壤高出許多倍，鎘在成熟煙株的不同葉位含量幾乎相當，而在根中最低， 煙葉中鎘的積累量占總吸收量的79-96%。
[0004] 內生真菌（endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植 物組織中，宿主無明顯病癥的一類真菌（Petrini，1991 ;Wilson，1995)，與菌根真菌只 存在于植物根系不同，內生真菌在植株的地下和地上部分的任何組織器官都能存在 (Faeth&Fagan，2002)。內生真菌廣泛存在于植物組織內，不受外界環境的影響，對植物生長 發育、抵抗病蟲害等具有廣泛的生物學作用，同時在一些植物及農作物的廣泛應用具有重 要意義。隨著環境問題的持續惡化，植物資源經受著嚴峻的考驗，而內生真菌對植物的影響 是多方面的，已經成為當今國內外研究的熱點問題之一。在農業生產、生態保護、中藥資源 開發、醫藥衛生的發展都有重要的現實意義。近年來，人們發現在植物體存在有益的內生細 菌和內生真菌，內源性菌株對植物病害的防治作用及生物開發應用已引起科學家的廣泛關 注。植物內生真菌主要分布于植物的種子、花、莖、葉和根系中，與植物的關系是互惠共生 的，而且植物內生真菌可以提供光合產物及礦物質，內生真菌代謝產物能夠刺激寄主植物 的生長發育，提高寄主植物的生物應激和非生物脅迫抗性能力，即兩者之間存在物質與能 量的循環交流，植物內生真菌對寄主植物的積極地促生效應，部分是通過植物內生真菌分 泌的活性物質或者次級代謝產物對植物的生長作用的結果。目前研究較多的是根瘤共生 體和菌根共生體，內生真菌與植物的共生體是高等植物與微生物共生關系的又一種表現形 式。
[0005] 內生真菌與植物的互作研究已日益受到研究者的關注，并成為內生真菌研究領域 的國際熱點。煙草作為我國重要的經濟作物，在國民經濟中占據著不可替代的地位，煙草產 量和品質的提高，是煙草產業健康發展的基礎。通過研究內生真菌與煙草的互作關系，對研 究內生真菌與煙草的共生體系具有重大意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種內生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05及其用途。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種內生真菌菌株（Rhizopycnis sp.) NYN8C05,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號： CCTCC N0:M2015219,保藏時間 2015 年 4 月 10 日。
[0008] 內生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的特征為：菌落生長較慢，呈灰黑色， 表生絨毛狀灰色菌絲。菌落背面灰色至灰黑色，間淡色輪紋，明顯輪紋狀。菌絲暗色有隔且 多分支，厚垣孢子形態球形、表面不光滑，多個厚垣孢子串聯成鏈狀。ITS rDNA區的序列分 析鑒定為Rhizopycnis sp.，ITS序列見序列2。
[0009] 菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05來源于煙草的內生真菌，該菌株屬于真菌界 Fungi，子囊菌門 Ascomycota，盤菌亞 Pezizomycotina，座囊菌綱 Dothideomycet，格孢腔菌 目 Pleosporales ;根盤菌屬 Rhizopycnis。
[0010] 本發明還提供上述內生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的用途：降低煙葉 中錦、砷、鉛的含量。
[0011] 上述的內生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的用途：降低煙葉中錦、砷或鉛 的含量。
[0012] -種內生真菌菌肥制劑，該內生真菌菌肥制劑包括所述的內生真菌菌株NYN8C05。
[0013] -種上述的內生真菌菌肥制劑的制備方法，該方法包括以下的步驟：
[0014] 1)菌株活化、一級種子培養、二級種子培養
[0015] 菌株活化：用滅菌的牙簽挑取PDA斜面保存管中的少許菌絲，接種于PDA培養基 上，封口后置于恒溫培養箱中，24h黑暗，25°C，活化培養；
[0016] -級種子液培養：將10塊直徑5mm的菌餅，接種于在200ml液體種子培養基中，于 150以11^11，25°(：培養7211;
[0017] 二級種子液培養：200ml -級種子液用攪拌器打碎并搖晃混勾，吸取20ml接種于 200ml液體種子培養基，于150r/min，25°C培養72h ;
[0018] 2)固態培養：
[0019] 200ml二級種子培養液打碎并搖晃混勾，吸取2ml接種于10g固態培養基質中，于 25°C條件下黑暗培養7d ;
[0020] 3)內生真菌菌肥制劑的制備
[0021] 稱取200g麩皮，添加100ml水，拌勻后置于1000ml錐形瓶內，8層紗布4層報紙封 口后，121°C，0. 15Mpa 滅菌 30min，冷卻備用；
[0022] 每個滅菌待的麩皮培養基，接種二級培養液40ml，置于恒溫培養箱中，24h黑暗， 25°C，培養。
【附圖說明】
[0023] 圖1為Rhizopycnis sp. NYN8G01在PDA培養基上的菌落形態。
[0024] 圖2為Rhizopycnis sp. NYN8G01在顯微鏡下的形態觀察，可見菌絲上著生單瓶梗 和分生孢子（左）以及鐮刀狀分生孢子（右）。
[0025] 圖3為Rhizopycnis sp. NYN8C05在PDA培養基上的菌落形態。
[0026] 圖4為Rhizopycnis sp. NYN8C05在顯微鏡下的形態觀察，可見菌絲上著生單瓶梗 和分生孢子（左）以及鐮刀狀分生孢子（右）。
[0027] 圖5為Lecanicillium sp. NYN771C06在PDA培養基上的菌落形態。
[0028] 圖6為Lecanicillium sp. NYN771C06在顯微鏡下的形態觀察，可見菌絲上著生單 瓶梗和分生孢子（左）以及鐮刀狀分生孢子（右）。
【具體實施方式】
[0029] 參照上述附圖，對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。
[0030] 備注說明：下述所有的培養基使用前均需要按照常規方式進行高溫高壓的滅菌處 理（121°C、0· 24MPa、20 分鐘）。
[0031] 實施例1、內生真菌菌株分離獲得
[0032] 2%麥芽汁瓊脂培養基（malt extract agar，MEA):在麥芽浸出粉20g、瓊脂20g中 加蒸餾水定容至l〇〇〇mL ;然后進行常規的高溫滅菌（1. 1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0033] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar, PDA):在馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL ;然后進行常規的高溫滅菌（1. 1個大氣壓，121°C 下滅菌20min)。
[0034] 以河南南陽煙區采集煙草為植物材料，將采集的煙草用自來水漂洗干凈，煙草根 莖在75% (v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1% (v/v)次氯酸鈉溶液中消毒10分種，無 菌水漂洗3次。用無菌刀片將根切成約0. 6cm長的片段，置于含50 μ g · ml-1氨芐青霉素 和50 μ g ·πι1-1鏈霉素的2%麥芽汁瓊脂培養基（MEA)平皿上，25°C暗培養，待菌絲長出后， 將菌絲頂端移接到PDA培養基；分離得到菌落，25 °C暗培養，在PDA培養基上連續三次接種， 確認為單菌落，沒有其他真菌或者細菌共同生長，認為是獲得純培養，獲得的三株內生真菌 分別為 NYN8G01、NYN8C05 和 NYN771C06。
[0035] 菌株編號為Rhizopycnis s