整合素αVβ8中和抗體的制作方法
【專利說明】整合素 α νβ 8中和抗體
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2010年2月18日提交的第61/305, 749號美國臨時申請以及2010年 12月30日提交的第61/428, 814號美國臨時申請的優先權，上述申請的公開內容以其整體 并入本文作為參考。
[0003] 對于在聯邦政府資助的研究和開發下完成的發明的權益聲明
[0004] 在國立衛生研究院授予的批準號HL63993、NS-44155、U01AI075443下，通過政府 的支持完成本發明。政府具有本發明的某些權利。
[0005] 發明背景
[0006] 多功能細胞因子轉化生長因子(TGF-β )在無脊椎動物和脊椎動物物種的發 育和成年生活期間的免疫細胞、內皮細胞、上皮細胞和間質細胞的生物學中起到重要作用。 在哺乳動物中，這些功能通過三種異構體，即TGF-β 1、2和3來介導，所述三種異構體各自 被廣泛地表達。所有三種異構體與相同的細胞表面受體（TGFBR2和ALK5)相互作用，并通過 相同的細胞內信號轉導通路而信號轉導，所述通路包括規范的（即SMAD)或非規范的（即 MAPK、JUN、PI3K、PP2A、Rho、PAR6)信號轉導效應器。已經非常集中地研究了規范TGF-β信 號轉導通路，借此通過細胞質SMAD-2/3的磷酸化、與SMAD-4的復合物形成、SMAD-2/3/4復 合物的核轉運以及與位于纖維發生反應所涉及的許多基因的啟動子區域的SMAD反應元件 結合，從TGF-β受體裝置傳播TGF-β信號轉導。然而，盡管具有相似的信號轉導伙伴，但 每一異構體提供單獨的生物功能，可能歸因于與TGF-β受體的結合親和力、激活機制、信 號轉導強度或持續時間、或者空間和/或時間分布的差異。
[0007] TGF-β異構體、受體和信號轉導介體以及靶向所有TGF-β異構體的功能阻斷劑 的敲除和條件缺失模型已經揭露了 T細胞、心臟、肺、血管和腭部發育中的TGF-β的重要作 用。例如，在TGF-β 1中存在缺陷的小鼠由于卵黃囊血管形成而在子宮內死亡，或者出生并 存活為成年壽命，但出現嚴重的多器官自身免疫。TGF-β信號轉導介體的基因缺失已表現 出在早期模式形成（patterning)和中胚層形成中Smad2的重要作用，并且缺少Smad3的小 鼠是有生命力并可育的，但表現出肢體畸形、免疫調節異常、結腸炎、結腸癌和齒槽肥大。在 成年組織中，TGF-β通路被認為調節免疫細胞、間質細胞和上皮細胞的動態相互作用以保 持對環境脅迫的內穩態。
[0008] 由TGF-β介導的正常內穩通路在對長期重復損傷的反應中受到擾亂。對于損傷， TGF- β變為主要的促纖維化細胞因子，通過抑制上皮增殖和迀移并且促進細胞死亡來延遲 上皮創傷康復，以及通過誘導纖維原細胞補充、纖維原細胞收縮和細胞外基質沉積來擴張 間質室。實際上，腺病毒重組TGF-βΙ向嚙齒動物肺部的氣管內轉移顯著增加了氣道周圍 和肺間質中的纖維原細胞積聚以及I型和III型膠原的表達，并且中和抗-TGF-β抗體能 阻斷實驗性博來霉素或輻射誘導的肺纖維化。
[0009] TGF-β通路的增加的活性還涉及纖維化肺病、腎小球硬化癥和心血管再狹窄。大 多數TGF-β介導的病理學變化可能歸因于TGF-β 1異構體。由具有在TGF-β 1自身或其信 號轉導效應器中廣泛的或細胞類型特異性的增強或缺陷的遺傳病癥來說明人類的TGF-β 1 功能的復雜性。增加 TGF-β通路活性的突變導致骨代謝（即，Camurati-Engelmann疾病） 和結締組織（即，Marfan綜合征）以及主動脈瘤（即Loeys-Dietz綜合征）的缺陷，而導 致TGF-β通路的降低活性的突變與癌癥發生和預后相關。然而，TGF-β作為癌癥的腫瘤 抑制劑的作用并非明確的，因為TGF-β也能通過其在免疫抑制、細胞侵襲、上皮-間質轉化 或血管生成中的作用而增強腫瘤生長和轉移。
[0010] 盡管TGF-β的多種重要功能，但單一劑量或短期給藥泛-TGF-β中和抗體已被報 道在抑制器官纖維化或實驗性癌細胞生長和轉移的劑量下完全耐受，并且未報道在成年小 鼠和大鼠中的副作用。該治療已表明在抑制實驗性纖維化中的治療效能。由于這些有希望 的結果，對于轉移性腎細胞癌、黑素瘤、局灶性節段性腎小球硬化和特發性肺纖維化，已經 進行或者正在進行使用中和泛-TGF-β抗體的單劑量I/II期臨床試驗（Genzyme Corpora tion, genzymeclinicalresearch. com,最近的訪問于 2009 年 8 月 27 號）。TGF-β 通路對 最小化全身作用的仔細靶向是高度期望的目標。
[0011] 發明簡述
[0012] 本發明涉及通過向有需要的個體給予整合素 ανβ 8的拮抗劑而降低個體、例如 人類或非人類中TGF0激活的方法，由此降低個體中的TGF0激活。在一些實施方案中， 拮抗劑降低TGF0激活（例如，切割潛態TGF0由此釋放成熟的活性TGF0肽的蛋白酶募 集），但未顯著抑制α ν β 8對TGF β的粘附（例如，在細胞表面上表達的α ν β 8對與細胞 基質相關的潛態TGF β的粘附）。
[0013] 在一些實施方案中，拮抗劑為抗體。因此，本發明提供了分離的抗體，其抑制活 性的成熟TGF0肽的釋放（TGFi3激活），但未顯著抑制TGF0對在ανβ8表達細胞上的 ανβ8的粘附。在一些實施方案中，抗體特異結合至ανβ8,例如特異結合至β8。在一 些實施方案中，抗體結合至在SEQ ID Ν0:11內的β 8上的表位。在一些實施方案中，表位 包括至少一個選自以下的氨基酸：人類β 8的氨基酸1125、R128、R175、F179和F180。在 一些實施方案中，抗體結合至少一個選自以下的氨基酸：人類β 8的氨基酸R79、185、S95、 Ρ100、1108、Ρ109、R128、Η140和F179。在一些實施方案中，抗體結合至少一個選自以下的 氨基酸：人類0 8的氨基酸174、呢8、11〇7、111〇、1125、1?175和？18〇。在一些實施方案中， 抗體結合人類β 8,而非小鼠 β 8。在一些實施方案中，抗體降低TGF0激活，但未顯著抑制 α ν β 8-介導的細胞對TGF β的粘附。
[0014] 在一些實施方案中，抗體與具有輕鏈可變區域和重鏈可變區域的抗體競爭與 ανβ8的結合，其中所述重鏈可變區域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的 三個重鏈CDR，所述輕鏈可變區域包括SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID Ν0:10的三個輕 鏈CDR。在一些實施方案中，抗體具有輕鏈可變區域和重鏈可變區域，其中所述重鏈可變區 域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7的三個重鏈CDR，所述輕鏈可變區域包 括SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10的三個輕鏈CDR。例如，在一些實施方案中， 抗體具有SEQ ID N0:3或4的輕鏈可變區域和SEQ ID N0:1或2的重鏈可變區域。本發明 的抗體的具體實例包括具有SEQ ID N0:3輕鏈可變區域和SEQ ID NO: 1重鏈可變區域的抗 體，并且抗體具有SEQ ID N0:4輕鏈可變區域和SEQ ID N0:2重鏈可變區域。
[0015] 抗體能具有多種同種型，例如IgGl、IgG2、IgG2a、IgG3或IgG4。能使用單克隆或 多克隆抗體。在一些實施方案中，抗體為人類、人源或嵌合抗體。
[0016] 本發明還提供了適于編碼本發明抗體的分離的核酸、一個載體或多個載體以及宿 主細胞。
[0017] 本發明還涉及包含本發明抗體和藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在一些實施 方案中，藥物組合物為用于診斷的，例如包含標記抗體。在一些實施方案中，藥物組合物為 用于治療的。
[0018] 在一些實施方案中，抗體用于檢測，例如體內或體外測定的β 8的存在。在這類 實施方案中，抗體由可檢測部分直接或間接地標記。因此，在一些實施方案中，本發明提供 給了測定生物樣本（體外或體內）中整合素 β 8存在的方法，其包括使生物樣本與本發明 的標記抗體接觸，并且測定標記抗體的存在，由此測定整合素 β 8的存在。在一些實施方 案中，所述方法用于診斷疾病狀態，所述疾病狀態選自關節炎、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、 哮喘、纖維化病癥、炎性大腦自身免疫性疾病、多發性硬化、脫髓鞘疾病（例如，橫貫性脊髓 炎、德維克病、格林-巴利綜合征）、神經炎癥、腎疾病、腺癌、鱗狀細胞癌、膠質瘤、乳腺癌以 及癌癥生長和轉移。
[0019] 本發明還涉及表達人類整合素 β 8的轉基因小鼠。在一些實施方案中，本發明的 轉基因小鼠不表達小鼠整合素 β 8。
[0020] 本發明的組合物和方法能用于降低個體中TGFi3激活，所述個體患有選自以下的 一種或多種疾病狀態：關節炎、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、哮喘、纖維化病癥、炎性大腦自 身免疫性疾病、多發性硬化、脫髓鞘疾病（例如，橫貫性脊髓炎、德維克病、格林-巴利綜合 征）、神經炎癥、腎疾病、腺癌、鱗狀細胞癌、膠質瘤、乳腺癌以及癌癥生長和轉移，并且其中 TGF0降低導致疾病狀態的改善。在一些實施方案中，纖維化病癥為氣道纖維化、特發性肺 纖維化、非特異性間質性肺炎、感染后肺纖維化、彌漫性肺泡損傷、膠原血管疾病相關的肺 纖維化、藥物誘導的肺纖維化、矽肺、石棉相關的肺纖維化、呼吸性細支氣管炎、呼吸性細支 氣管炎性間質性肺炎、脫肩性間質性肺炎、隱源性機化性肺炎、慢性過敏性肺炎、藥物相關 的肺纖維化、腎纖維化或肝纖維化。
[0021] 發明詳述
[0022] 簡介
[0023] 本發明部分基于下述發現，即某些抗-α v β 8拮抗劑、抗-α v β 8抗體或免疫結合 物選擇性地擾亂α ν β 8介導的TGF- β激活，但未擾亂α ν β 8-表達細胞對固定的TGF- β 的粘附。因此，本發明提供給了通過向有需要的個體給予ανβ 8拮抗劑（例如，小分子、 抗-α ν β 8抗體或免疫結合物）而降低個體中TGF β激活的方法，由此降低個體中TGF β 激活。本發明還提供了新的具有輕鏈可變區域和重鏈可變區域的抗體，其中所述重鏈可變 區域包括SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6和SEQ ID Ν0:7的三個重鏈CDR，所述輕鏈可變區域 包括 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID 勵：10的三個輕鏈〇?。
[0024] 定義
[0025] 術語"整合素 β 8"與itgb8、ITGB8、β 8等術語可交換地使用。ITGB8通常用于指 人類序列，而itgb8是指小鼠序列。人類蛋白序列能在Uniprot登記號Ρ26012中找到，而 小鼠序列具有Uniprot登記號Q0VBD0。
[0026] "拮抗劑"所指的作用劑具有抑制本發明的多肽或多核苷酸的表達或與本發明多 肽或多核苷酸結合，部分或全部阻斷本發明多肽或多核苷酸的刺激，降低、防止、延遲本發 明多肽或多核苷酸的激活，失活、脫敏或下調本發明多肽或多核苷酸的活性。拮抗劑能中和 活性（例如，通過天然配體來防止結合和激活）或積極地降低活性。
[0027] 在兩個或多個核酸或多肽序列的語境中的術語"同一的"或"同一性"是指相同 的或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸（即，當在比較窗口或指定區域上比較或 比對最大對應時，為約60%同一性，優選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 %或更高的同一性）的兩個或多個序列或子列，如使 用具有下述缺省參數的BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法或通過人工算法和目測（參見， 例如NCBI網址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等）所測量的。那么，將這類序列稱為"基本 同一的"。本發明提供了例如具有多核苷酸或多肽序列的抗體，所述序列與對照序列（例 如 SEQ ID N0s:l-10)相比具有至少 80% 同一性，優選 85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。該定義還指測試序列的補體或可以用于測試 序列的補體。定義還包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些。如下所述，優 選的算法能解釋缺口等。優選地，在至少約25個氨基酸或核苷酸長的區域內存在同一性， 或者更優選地在50-100個氨基酸或核苷酸長的區域內存在同一1性。
[0028] 對于序列比較，通常，一個序列用作參照序列，測試序列與其比較。當使用序列比 較算法時，將測試和對照序列輸入計算機，然后指定坐標（若需要），并且指定序列算法程 序參數。優選地，能使用缺省程序參數，或者能指定可替換的參數。然后，序列比較算法基 于程序參數計算測試序列相對于對照序列的序列同一性百分數。
[0029] 如本文所用，"比較窗口"包括與連續位置數的任一個的片段的對照，所述連續 位置數選自20至600,通常約50至約200,更通常約100至約150,其中序列可以在將 兩個序列最佳比對之后與相同的連續位置數的對照序列比較。用于比較的序列比對方 法在本領域中公知。能例如通過Smith&Waterman，Adv.Appl. Math. 2:482(1981)的局部 同源算法、通過Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源比對算法、通過 Pearson&Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的對于相似性方法的研究、 通過這些算法的電腦化實施（在Wisconsin Genetics軟件包中的GAP, BESTFIT, FASTA和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr·, Madison, WI)或者通過人工比對和目 測（參見，例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編輯，1995 增 刊））來進行用于比較的最佳序列比對。
[0030] 適于測定序列同一性百分數的算法和序列相似性為BLAST和BLAST 2. 0算法，其 分別在 Altschul 等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中描述。使用具有本文所述參數的BLAST和BLAST 2.0以測定本 發明的核酸和蛋白的序列同一性百分數。進行BLAST分析的軟件通過國家生物技術信息中 心（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)而為公開可得的。該算法包括通過確定查詢序列中 長度W的短字段來首先確定高分序列對（HSP)，所述查詢序列當與數據庫序列的相同長度 的字段比對時匹配或滿足某些正-閥值分數T。T稱為鄰域字段分數閥（Altschul等人，同 上）。這些初始的鄰域字段匹配用作開始搜索的種子以找到包含它們的更長的HSP。字段匹 配在沿每一序列的兩個方向上延伸，直到能增加累積比對分數。對于核苷酸序列，使用參數 M(匹配殘基的對的獎勵分數；通常>0)和