一種抗血管生成的多肽nr16及其改造肽的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥技術領域，具體涉及一種具有抗血管生成作用的多肽NR16及其改造肽[D-Ala^ARH。
【背景技術】
[0002]血管生成是在原有血管內皮細胞的基礎上形成新血管的自然過程。研究表明，實體瘤的生長依賴于新生血管生成，血管生成在腫瘤生長和轉移過程中起著非常重要的作用，不僅可以為腫瘤生長和轉移提供必需的氧氣和營養物質，而且可以排泄代謝產物。抗腫瘤血管生成療法具有很多優點:①具有高效性，破壞少量的血管可使依靠其生長的大量的腫瘤細胞發生缺血性壞死血管細胞無或少突變，不易產生耐藥性，可長期用藥；③廣泛的抑瘤譜，不同腫瘤的血管內皮細胞往往表達相同的特異性蛋白分子，針對這種蛋白分子的一種療法就可能適用于多種腫瘤藥物易于到達靶細胞，血管內皮細胞直接暴露于血液中，藥物能直接發揮作用。
[0003]內皮細胞受體酪氨酸激酶VEGF-R2和Tie_2，及其配體血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素Angl和Ang2，在血管生成中起著重要作用。通過封閉VEGF受體途徑或者封閉Tie-2受體途徑，都能抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，并且抑制VEGF受體傳導途徑不能被Tie-2傳導途徑所補償，反之亦然，兩個途徑相對獨立，且同樣重要；即同時抑制由VEGFR-2和Tie-2介導的信號通路比單獨抑制其中一條通路有更強的維持正常血管及腫瘤相關血管完整和穩定的能力。
[0004]AS16作為一種由VEGFR2受體拮抗劑ATWLPPR (VI肽)和Tie2受體拮抗劑NLLMAAS (V2肽)通過柔性連接子(A— A)連接的多肽，在現有專利中已得到較為充分公開(CN101830971，一種新型抗腫瘤血管生成多肽)。但是作為一種多肽類藥物，由于其分子量較小，在生物體內容易被酶降解，半衰期短，因而治療效果容易受到較大影響，同時其對于抑制腫瘤新生血管生成的作用效果也存在進一步提升的空間。
【發明內容】
[0005]本發明主要目的是在現有AS16多肽基礎上，通過對其研究改造，獲得了一種新的多肽NR16及其改造肽[D-Ala^ARH，新的多肽結構相較于原有的AS16多肽，同樣表現出較好地抗腫瘤血管生成作用，為抗腫瘤藥劑的應用提供了新的可能。
[0006]下面對本發明的技術方案詳細介紹如下。
[0007]—種抗血管生成多肽NR16及其改造肽，所述多肽NR16含有16個氨基酸，分子量為1683.0，序列如序列表SEQ ID N0.1所示，具體氨基酸序列為:
Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即 NLLMAASAAATWLPPR ；
相較于原有多肽AS16，在結構上其主要區別是ATWLPPR肽段與NLLMAAS肽段的連接順序發生了顛倒； 所述AS16為現有專利中已公開的(申請號:2010101722261，公開號:CN101830971A，一種新型抗腫瘤血管生成多肽，在該專利中成為V3肽)多肽序列。
[0008]所述NR16改造肽，命名為[D-Ala^ARH，包含17個氨基酸，其分子量為1754.1，序列所SEQ ID N0.2所示，具體氨基酸序列為:
D-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即D-ANLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽[D-Ala1] AR17，通過在NR16肽N端增加一個D_Ala實現；
所述D-Ala、D-A代表該多肽序列中第一個氨基酸丙氨酸為D-構型。
[0009]所述抗血管生成多肽NR16及其改造肽的制備方法，均采用Fomc固相多肽合成法制備而成，過程為:
首先將第一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；
其次將氨基被Fmoc基團保護的第二個氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基發生脫水縮合反應，形成肽鍵；
重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割合成的多肽，經過乙醚沉淀與洗滌，得到粗肽；
經HPLC純化后即可制得較高純度的多肽樣品。
[0010]具體包括以下步驟:
(1)溶脹樹脂，于多肽合成儀中溶脹Wang樹脂；
(2)第一個氨基酸的添加，計算稱取精氨酸，同時按比例加入H0BT(1-羥基苯丙三唑)、DIC (Ν, Ν- 二異丙基二亞胺)，反應，反應結束后加封頭液封頭，洗滌；
(3)第二個氨基酸即脯氨酸的添加，合成是從肽鏈的C端到Ν端方向進行，對步驟(2)中第一個氨基酸添加后樹脂脫保護，洗滌，然后茚檢，按比例加入第二個氨基酸脯氨酸、Η0ΒΤ、DIC，反應，洗滌；
(4 )后續氨基酸的添加，添加的方法同上述第二個氨基酸的添加過程，直至加完所有氨基酸；
在制備NR16改造肽[D-Ala1]AR17時，需要注意的是，除了最后一個氨基酸改為D型丙氨酸，其他的氨基酸均為L型氨基酸；
(5)多肽的切割，向步驟(4)中裝有樹脂的多肽合成儀中加入適量的脫保護液，洗滌；然后在通風櫥中將配置好的切割試劑倒入合成儀中進行切割反應；切割完畢后，用旋轉蒸發儀將切割液中的TFA去除；由于多肽序列中含有精氨酸，需再進行冰切；冰切完成后獲得粗肽；粗肽烘干后利用RP-HPLC純化，純化后產物首先于_80°C低溫冰箱冷凍過夜，然后用冷凍干燥機凍干成白色粉末后于-20°C冰箱保存備用，即為所合成的多肽成品。
[0011]所述抗血管生成多肽NR16及其改造肽，在作為腫瘤治療藥物中的應用，所述腫瘤例如H22肝癌所導致腫瘤。
[0012]現有技術中，多肽AS16雖然表現出較好的抑瘤效果，但就作為藥劑實際而言，仍然存在藥劑類型單一，效果有待進一步提高等缺陷。本發明所提供的多肽NR16及其改造肽[D-Ala1] AR17，與多肽AS16結構存在一定的類似程度，同時更為重要的是，同樣表現出了較好的抑瘤效果，因而就其未來應用前景而言，是可以較好地作為多肽AS16的補充甚至替代多肽AS16的，同時也為未來新的腫瘤藥劑的研制、開發提供新的借鑒和可能。
【附圖說明】
[0013]圖1為AS16的質譜鑒定圖；
圖2為NR16的質譜鑒定圖；
圖3為[D-Ala1]AR17的質譜鑒定圖；
圖4為多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17對Balb/c小鼠的生長曲線圖；
圖5為多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17對Balb/c小鼠的H22瘤重；
圖6為多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17對Balb/c小鼠的抑瘤率。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。在介紹具體實施例前，對本發明中所用部分樣品、藥劑及儀器設備簡要說明如下。
[0015]實驗試劑
Fomc固相多肽合成中，Wang樹脂和Fmoc保護的L型氨基酸及D型氨基酸均購于吉爾生化(上海)有限公司；
細胞培養中，RPM1-1640培養基(500mL/瓶)購于北京Solarb1公司；FBS (胎牛血清，100mL/瓶)購于杭州四季青生物有限公司。
[0016]小鼠樣品及癌細胞
Balb/c小鼠，無特定病原體動物(SPF)級，雌性，18-20g，購自北京華阜康生物醫藥科技有限公司；
昆明小鼠，清潔級，18-20g，河南省實驗動物中心提供；
H22小鼠肝癌細胞，來自于河南省醫學科學研究院。
[0017]Balb/c小鼠移植瘤模型的建立具體步驟如下:
(1)取出在培養瓶中培養的H22小鼠肝癌細胞，調整細胞濃度至IX107個/mL，常規消毒；用lmL注射器吸取0.2mL (含2 X 106個細胞)腫瘤細胞(H22小鼠肝癌細胞)懸液，注射入昆明小鼠的腹腔內；
(2)將H22小鼠肝癌細胞經過兩次以上腹腔傳代之后，取出腹水，800r/min離心8min，棄上清，生理鹽水重懸，吸取重懸液用0.2%臺盼蘭染色，顯微鏡下觀察確認細胞成活率>95%時可以進一步應用。調整細胞濃度至1\107個/!^，常規消毒備用；
(3)吸取0.2mL (含2X 106個細胞)腫瘤細胞(H22小鼠肝癌細胞)懸液注射入Balb/c小鼠右上肢腋下，建立Balb/c小鼠移植瘤模型，并觀察記錄腫瘤的生長情況。
[0018]實施例1
本申請所提供的抗血管生成多肽NR16及其改造肽，所述多肽NR16含有16個氨基酸，分子量為1683.0，具體氨基酸序列為:
Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即NLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽，命名為[D-Ala^ARH，包含17個氨基酸，其分子量為1754.1，具體氨基酸序列為:
D-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即D-ANLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽[D-Ala1] AR17，通過在NR16肽N端增加一個D_Ala實現；
所述D-Ala、D-A代表該多肽序列中第一個氨基酸丙氨酸為D-構型。
[0019]AS16為現有專利中已公開的(申請號:2010101722261，公開號:CN101830971A，一種新型抗腫瘤血管生成多肽，在該專利中為V3肽)多肽序列，與現有多肽序列相比，多肽NR16在結構上與其主要區別是ATWLPPR肽段與NLLMAAS肽段的連接順序發生了顛倒。
[0020]多肽NR16采用Fomc固相多肽合成法制備而成，具體制備過程如下:
(1)溶脹樹脂，稱取0.3g的Wang樹脂，再將稱量好的Wang樹脂倒入洗干凈且干燥的多肽合成儀中，之后加入DMF