萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法和應用，具體涉及一種萊克多巴胺半 抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用，用于檢測動物組織和尿液 中的萊克多巴胺殘留量，屬于免疫學檢測領域。
【背景技術】
[0002] 萊克多巴胺是一種醫藥原料，具有廣泛的生理效應，可用于治療充血性心力衰竭 癥的強心藥，且常用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產科疾病的治療。當其用量增加到臨床用 量的5-10倍時，可增加肌肉生長，減少脂肪蓄積，是良好的營養分配劑和生長促進劑。美國 FDA在2000年批準，可以用于動物營養重新配劑，廣泛地用于畜牧業和養殖業。可以同時提 1?動物的日增重，提1?詞料利用率，提1?動物的蛋白質含量。但是其在動物體內的殘留一旦 經食物鏈進入人體，會對食用者產生巨大危害，特別對心臟病、糖尿病、高血壓、甲亢、青光 目艮、前列腺肥大等病人危害更大，甚至死亡，如瘦肉精(萊克多巴胺是"瘦肉精藥物"中的一 種）在上海曾經引發幾百人的中毒事件；在臺灣由于從美國進口的豬肉里含有瘦肉精，幾乎 挑起一場政治爭端。目前我國禁止將β-激動劑等藥物作為動物促生長劑使用。但長期以 來，各種因非法使用β-激動劑而造成的中毒事件時有發生。為打擊非法用藥，保護消費者 的健康與安全，迫切需要健全相關的檢測方法。
[0003] 目前，獸藥殘留檢測常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質聯用等理化 分析方法。雖然這些方法特異性強、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也 不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫化學分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨特的優 勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優點彌補了理化分析的不足，在 萊克多巴胺的殘留檢測中起著越來越重要的作用。
[0004] 影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質又決定于 免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計與合成是產生特異性抗體和建立小分 子獸藥殘留快速檢測技術的最基礎和最關鍵的步驟。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免 疫熒光試劑盒中的應用。
[0006] 本發明提供的萊克多巴胺半抗原，為式（I)所示的化合物；
本發明還公開了式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟： 1、取500mg萊克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348. 8mg6-溴己酸和233mg氫氧化鉀， 加熱至80度回流反應40~72小時。點板確定原料大部分轉化。
[0007] 2、減壓濃縮。使用15ml復溶，使用制備薄層色譜板分離純化，展開劑DCM:ME=4:1， 以萊克多巴胺標準定位，取比其極性大的點，使用甲醇提取，濃縮即得RAC-BBAR。
[0008] 本發明提供的萊克多巴胺抗原，是將式I所示化合物和載體蛋白偶聯得到的偶聯 物。
[0009] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0010] 所述式I所示化合物與BSA偶聯得到的萊克多巴胺抗原的結構見式II:
本發明還公開了所述萊克多巴胺抗原的制備方法，包括如下步驟： 1、取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10. 7mlDMF中，攪拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室溫反應 3h。
[0011] 2、稱取144.lmgBSA溶于15ml0· 1M碳酸緩沖溶液（ρΗ=9· 6)中，攪拌lOmin，充 分溶解。
[0012] 3、將步驟1的活化液3. 6ml，在冰水浴環境下逐滴加入到蛋白溶液中，邊加邊攪 拌，室溫磁力攪拌（400rpm)反應24h。
[0013] 4、將反應產物裝入一個蒸餾水沖洗干凈的透析袋（15cm)，1LPB(IX，pH7. 2)室溫 攪拌（lOOrpm)透析3d，每天換液3次(早中晚各一次)，共計換液9次，將透析產物4500rpm 離心6min，0. 5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存備用。
[0014] OVA代替BSA，同法制備可得包被原。
[0015] 所述萊克多巴胺抗原可以作為免疫原制備萊克多巴胺特異性抗體，也可以作為包 被原制備微孔板。
[0016] 應用萊克多巴胺抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0017] 所述萊克多巴胺抗原、所述特異性抗體均可應用于檢測萊克多巴胺。
[0018] 本發明還保護一種用于檢測萊克多巴胺的量子點免疫熒光試劑盒，包括量子點標 記的所述抗體。
[0019] "量子點標記的所述抗體"的制備方法具體如下： ① 取2. 5mg量子點，用pH4. 7、0. 1M的MES緩沖液洗滌，然后用lmlpH4. 7、0. 1M的MES 緩沖液重懸，加入〇· 96mgEDC和1. 15mgNHS，37°C反應30分鐘，20000rpm離心5min，收集 沉淀，即為活化后的量子點； ② 取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將2. 5mg 活化后量子點、所述抗體(蛋白質含量為〇. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液混勻（總體積 為0· 8ml)，25°C反應3. 5小時； ③ 取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質量百分含量為5%，37 °C反應30分鐘， 20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液洗滌，用lmlpH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液重懸； ④取步驟③得到的液相，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液稀釋至150000倍體積。
[0020] 所述量子點熒光免疫試劑盒，包括：包被有萊克多巴胺抗原的微孔板、抗體工作 液、萊克多巴胺標準溶液、稀釋液、濃縮洗滌液等。
[0021] 本發明還保護以上所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有萊克多巴胺中的應用。
[0022] 本發明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學反應，定量的檢測樣品中微量小分子目標分 析物。本發明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產率較高。本發明克服了現有檢測技術 中對萊克多巴胺樣品預處理復雜、耗時、且需要大量有機溶劑萃取，以及在檢測過程中要用 到精密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等缺點。本發明的萊克多巴胺抗原，通過免疫動 物可產生了針對萊克多巴胺的特異性抗體，用于快速檢測食品中的萊克多巴胺殘留，具有 操作簡單、快速，處理樣品量大，靈敏度高，特異性強等諸多優點。
【附圖說明】
[0023] 圖1為量子點的掃描圖。
[0024] 圖2為萊克多巴胺量子點免疫熒光試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0025] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果 取平均值。實施例1中的攪拌都是采用磁力攪拌器進行的，所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
[0026] 萊克多巴胺的結構式如下：
頭施例1、免疫原和包被原的制備 一、半抗原的制備 1、取500mg萊克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348. 8mg6-溴己酸和233mg氫氧化鉀， 加熱至80度回流反應40~72小時。點板確定原料大部分轉化。
[0027] 2、減壓濃縮。使用15ml復溶，使用制備薄層色譜板分離純化，展開劑DCM:ME=4:1， 以萊克多巴胺標準定位，取比其極性大的點，使用甲醇提取，濃縮即得RAC-BBAR，得到的干 物質即為半抗原。
[0028] 半抗原的結構式見式（I)。
[0029]
[0030] 二、免疫原的制備 1、取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10. 7mlDMF中，攪拌使之充分溶解。加入EDC221.75mg和NHS191.4mg，室溫反應 3h。
[0031] 2、稱取144.lmgBSA溶于15ml0· 1M碳酸緩沖溶液（ρΗ=9· 6)中，攪拌lOmin，充 分溶解。
[0032] 3、將步驟1的活化液3. 6ml，在冰水浴環境下逐滴加入到蛋白溶液中，邊加邊攪 拌，室溫磁力攪拌（400rpm)反應24h。
[0033] 4、將反應產物裝入一個蒸餾水沖洗干凈的透析袋（15cm)，1LPB(IX，pH7. 2)室溫 攪拌（lOOrpm)透析3d，每天換液3次(早中晚各一次)，共計換液9次，將透析產物4500rpm 離心6min，0. 5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存備用。
[0034] 免疫原的結構式見式（II)
[0035] 三、包被原的制備 用0VA代替BSA，其它同步驟二，得到包被原溶液。
[0036] 實施例2、多克隆抗體的制備 取實施例1制備的免疫原溶液，采用pH7. 4、0. 01M的PBS緩沖液稀釋，得到免疫原稀釋 液，用于多克隆抗體的制備。采用新西蘭大白兔作為免疫動物。
[0037] 免疫過程如下(免疫劑量以蛋白量計）： 首次免疫：將免疫原稀釋液與等體積的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多 點注射，免疫劑量為lmg/kg·b.w.; 加強免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各進彳丁一次加強免疫，將免疫原f布釋液 與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注射，單次免疫劑量為lmg/kg·b. w.; 末次免疫：首次免疫16周后進行末次免疫，直接頸背部皮下多點注射免疫原稀釋液， 免疫劑量為lmg/kg·b.w.。
[0038] 末次免疫1周后，采血并分離血清，即為免疫原對應的多克隆抗體(簡稱多克隆抗 體甲）。
[0039] 實施例3、量子點免疫熒光檢測試劑盒的組裝 量子點購自深圳市泰勒、斯科技有限公司，產品目錄號為TLS\umiQD?20。該量子點的 表征如下：粒徑為20nm、粒徑的CV為15%，量子產率為60%，表面羧基含量為5X10 3mmol/ mg，水溶性，CdSe/ZnS核殼結構，激發光波長為345nm，發射波長是620nm;紅色熒光量子點。 量子點的掃描圖如圖1所示。量子點上的羧基與蛋白質上的氨基形成肽鍵并連接起來。
[0040] 量子點免疫突光檢測試劑盒包括如下組件： 1、包被了包被原的微孔板 取實施例1制備的包被原溶液，