從哺乳動物組織分離的椎間盤細胞、使用方法及其制備方法
【專利說明】從晡乳動物組織分離的椎間盤細胞、使用方法及其制備方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]根據35U.S.C.§ 119(e)，本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請N0.61/794，691的優先權，其全部內容通過引用并入本文。
發明領域
[0003]該公開內容涉及椎間盤細胞的分離以及在退行性椎間盤疾病的治療中的使用方法。
[0004]發明背景
[0005]哺乳動物的脊椎起著兩大基本功能:(I)上半身的負載和(2)保護組成脊柱的神經。脊柱是由聯鎖的椎骨組成，由椎間盤分隔。這些(椎間)盤充當著減震器，并使脊柱能夠彎曲，壓縮，和扭曲。椎間盤具有兩個基本部分:外纖維結構(纖維環)和凝膠狀內部結構(髓核)。在青年哺乳動物體內，健康髓核的80%為水。隨著時間流逝，髓核的高含量水丟失，進而喪失吸收沖擊的能力。此外，椎間盤可由于脫水、疾病、過度使用、損傷或創傷引起破裂、腫脹、疝等。椎間盤也容易為其他疾病所影響，如椎間盤退行性病變。
[0006]在健康的椎間盤中，細胞只占有總體積的很小部分。大量的椎間盤體積是細胞產生的細胞外基質(ECM ;膠原蛋白和蛋白聚糖，其協助保留了大量的水分)，并且髓核和纖維環的大多數區別在于含水量和ECM的組成。
[0007]椎間盤退行性病變所導致的背部疼痛是導致發病、殘疾和喪失勞動力的一個重要原因。背部疼痛常常被認為是限制45歲以下人群活動以及就診、住院和外科手術的原因。每年，人群中15% -45%會報告慢性背部狀況發生，而在其生命的某一段時間，則有人群中70%至85%報告。在醫療健康支出以及喪失的工作時間方面，對于社會財政的影響巨大。在美國，每年需要進行一百多萬例脊椎手術。更有甚者，脊柱外科的腰椎節段融市場估計具有超過十億美元的年收入。
[0008]盡管對于遭受背部疼痛和脊柱疾病的患者的手術和非手術治療方案都在持續進步，卻沒有消除或持續改善這種狀態的解決方案。目前，脊柱疾病的治療方法包括類固醇注射，物理療法，椎間盤切除術和脊柱融合術。多家公司推出了脊椎假體。然而，這些假體在設計上，例如，在軸承表面、骨質固定、關節數量、材料、約束、旋轉的移動性上，有很大的不同，且在實踐中收效甚微。
[0009]核置換或髓核置換也是可作為治療退行性盤疾病的選擇。在一些情況下，這些設備由聚乙烯套筒包裹水凝膠核心組成其能使該裝置在正常裝卸過程中的收縮和溶脹。這可以部分地幫助恢復椎間隙高度，并有助于模仿健康人的盤。
[0010]盤置換并非沒有并發癥。最常見的并發癥包括鄰近水平的脊椎疾病、沉降和關節面炎癥。而且，來源于臨床試驗的最近研究表明了感染、椎體骨折、植入位置不正、沉降、機械故障和椎旁異位骨化的事件。還報道有更嚴重的并發癥，包括植入物的前脫位。此外，全椎間盤成形術中的磨損粒子產生和對脊髓的潛在影響的問題仍然是未知的。
[0011]目前所需要的是可有助于將對象的椎間盤進行修復或更換椎間盤生物療法。
[0012]發明概述
[0013]本文公開的是分離的椎間盤細胞群，其使用方法，以及制備方法。所述的椎間盤細胞群被用于修復、重建以及更換損壞、受傷、或患病的椎間盤。在一些實施方式中，椎間盤細胞群衍生自從哺乳動物椎間盤組織，并在體外以非貼壁依賴條件下生長。在一些實施例中，細胞培養基包含含有一種或多種選自下組的添加劑的介質:EGF、bFGF、血清，成纖維細胞調節介質，和粘性非反應性物質。在一些案例中，所述的細胞生長于含有低粘附涂層的容器中。所述的椎間盤細胞群可以在需要的對象中組合用于自體和/或非自體椎間盤治療。
[0014]所述的椎間盤細胞可使用非可吸收材料或可吸收材料而在體外或體內體內用作生產人工椎間盤替代物。所述的材料可以創建一個人工環來容納椎間盤細胞群，其可以單獨或與以下各項中的至少一種進行組合一一支架材料、基質材料、載體材料、生長因子和/或其它生物活性劑。人造環可以包括連接裝置，以便它可以被固定到一個或多個椎體上。例如，所述的人工換可以包括通孔、扣、連接端環、或墊圈，以使其能夠螺合固定至一個或多個椎體上。人造椎間盤可手術植入主體，從而完全取代椎間盤。
[0015]本申請公開了各種從自體和非自體供體來來獲得并椎間盤源性細胞的方法。本申請公開了一種椎間盤源性細胞群的衍生方法，所述的方法包括:從組織中分離一個或多個細胞；在貼壁依賴中對所述一個或多個細胞進行培養；將所述的一個或多個細胞轉移至非貼壁依賴中。本申請還公開了一種方法，通過向所需對象使用治療量的椎間盤源性細胞群以對所述對象至少一個椎間盤進行治療，從而治療所述對象。在各種實施方案中，所述的組織是哺乳動物椎間盤組織，例如，來自于捐贈的器官或脊椎。在一些方面，所公開的方法包括，將所述細胞群在貼壁依賴至少傳代一段時間，和所述細胞群產生細胞外基質。在一些方面，所述的細胞群產生一個或多個選自下組的細胞表面標記物:⑶24、⑶34、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、Stro-1、HIFl、巢蛋白、CK8和HLA蛋白，其中表達一個或多個細胞表面標記物的細胞在細胞群中的百分比大于70%或小于40%。在本發明所公開的方法的一些方面中，所述細胞群表達一種或多種選自下組的基因或基因產物:GAPDH、SDHA,HPRTl、B2M、Sox9、聚蛋白多糖、Co 11、Co 12、巢蛋白、CK8、Sox 1、CD44、ALP1、PPARG、ADAMTS、MMP、FMOD、和IL0
[0016]在另一方面，本申請描述了椎間盤源性細胞群，其中大于40%的所述細胞產生細胞表面標記物CD44、CD73、CD90、HLA-A、B或C、CD24、CD105、CD166、或其組合，且小于約20%的細胞群產生⑶34、HLA-DR或-DQ、或STR0-1。在一些實施方案中，約80-100%的細胞群產生⑶73、⑶90、⑶44、HLA ABC、或其組合。在一些實施方案中，約20-75%的細胞群產生CD105、CD166、CD24、或其組合。
[0017]根據一個方面，本發明提供一種治療至少一個椎間盤患有疾病或損傷的的對象的方法，所述椎間盤的疾病或損傷是由年齡、創傷、毒素暴露、藥物暴露、放射暴露、氧化、免疫復合物沉積或移植排斥誘發的。
[0018]根據另一個方面，本發明提供了用于治療至少一個椎間盤患有疾病或損傷對象的試劑盒，其包含藥學上可接受的載體，治療疾病或損傷有效量的椎間盤源性細胞，脊柱組織，并且其中所述細胞能夠在培養基中擴增，并具有分化的潛能。在一些實施例中，所述的試劑盒包括至少一種制劑。
[0019]附圖簡要說明
[0020]本專利的文件包含至少一張彩色圖片/照片。帶有彩色圖片/照片的本專利文件的副本在請求并支付了必要的費用情況下，將由專利局提供。
[0021]本發明的主題在說明書的結論部分被特別地指出并清楚地要求。然而，所述的發明無論是對于組織和操作方法，以及目的，特征和優點，通過以下詳述作為參考，當與附圖一同閱讀時，用于對本發明進行最好的理解，其中:
[0022]圖1示出的已知的，用于確定干細胞和成軟骨細胞的各種表面標記物表達譜。檢測了八種細胞類型:成纖維細胞，軟骨細胞，間充質干細胞(MSCs)，單層培養椎間盤細胞(貼壁)，以及懸浮培養的椎間盤細胞(非貼壁)。
[0023]圖2顯示了在懸浮培養基中生長的椎間盤源性細胞的細胞形態。
[0024]圖3顯示了椎間盤源性細胞與MSC的軟骨分化潛能對比。
[0025]圖4顯示了椎間盤源性細胞的成脂和成骨潛能。
[0026]圖5顯示了在與粘性I %透明質酸支架組合，然后通過27G1.5英寸手術針擠出后細胞的存活率(綠色，或在黑/白中顯亮色-活，紅色或黑/白中顯暗色-死)。
[0027]圖6示出用于治療用途的椎間盤源性細胞用以治療各種形式的椎間盤疾病的潛在的設備和制劑。治療可以通過注射(頂部)或植入(底部)。細胞和載體/支架可以是在一起的，或在使用前即刻混合。
[0028]圖7顯示了椎間盤源性細胞與粘稠支架載體形成的制劑修復兔椎間盤退行性變(動物模型)的體內功效。
[0029]圖8為表示椎間盤細胞的制備和植入的示意性流程圖。步驟a顯示了椎間盤的示意圖。步驟b顯示了從脊柱新鮮分離的人椎間盤。步驟c示出解剖和酶消化之后的髓核細胞。貼壁的細胞在EGF和FGF-2的存在下進行擴增。比例尺=50 μ m。步驟d是轉移至含有甲基纖維素的接觸抑制培養環境中的細胞纖維照片，其中，細胞簇和細胞球培養了約2個星期。比例尺= 200 μπι。步驟e是用于注射已洗去含有甲基纖維素的培養基并與未交聯的透明質酸支架相結合的細胞的注射器。步驟f示出了在兔退行性變椎間盤中的用于注射細胞和支架混合物的注射器，在此之后，進行了為期約I個月的安全性和有效性評估。
[0030]圖9A-F顯不了用于生廣聚蛋白多糖和Jj父原蛋白的椎間盤細胞。圖9A是蘇木精和伊紅染色的相位圖像。圖9B是阿爾辛藍與核固紅的對比染色相位圖像。注意單細胞周圍基質的存在(左)。比例尺=10微米。圖9C是天狼猩紅染色相位圖像。圖9D是一個共焦圖象，包括肌動蛋白(紅色)和細胞核(藍色)。圖9E是聚集蛋白聚糖，膠原蛋白和肌動蛋白(無核)的共焦圖像，附帶有放大圖，其中黑色箭頭表示細胞內聚集蛋白聚糖，而白色箭頭表示細胞外聚集蛋白聚糖。圖9F是條形圖，顯示了隨時間流逝，基質分子(聚集蛋白聚糖和膠原蛋白2A)在培養基內第14天的收獲和軟骨細胞分化后的RT-PCR分析。通過對管家基因HRPT的歸一化交叉閾值，以及第O天的基線基因表達，對表達倍數進行了計算。
[0031]圖10A-C描繪了對于椎間盤源性細胞的流式細胞儀研究。圖1OA是前向和側向散點圖，顯示了應用于所有后續分析的限制，包括89%的細胞群。圖1OB是表示5個不同人供體的椎間盤細胞的表達水平的柱狀圖，(相對于同種型對照)。圖1OC示出表面標記物表達的代表性直方圖。
[0032]圖1lA-E顯示了椎間盤細胞的多能性。圖1lA顯示了通過茜素紅染色顯示的成骨分化。圖1lB顯示了通過油紅O染色顯示的成脂分化。圖1lC顯示了微團形成后的成軟骨細胞分化(阿爾辛藍和核固紅)。比例尺=100微米。圖1lD是條形圖，顯示在軟骨形成細胞分化為軟骨細胞(AC)、成人成纖維細胞(FB)、骨髓來源的MSC、和椎間盤源性細胞(DC)之后，可溶性(介質)和不溶性(微團)GAG生產的定量評估。圖1lE為顯示了產生GAG總量歸一化到各種細胞類型的DNA含量的條形圖。直線表示顯著差異(p〈0.01，單因素方差分析和Bonferroni的事后檢驗)。
[0033]圖12A-顯示在兔盤退行性變模型中處理的安全性和有效性評估。圖12A是代表性的X射線，每2周進行，并用來在如圖所示的18骨個骨性標記基礎上計算椎間盤高度指數(DHI)。圖12B顯示了兔子體重(治療注射第14天)的研究期間保持在正常范圍內。圖12C是DHI在6周的治療中的曲線圖，顯示了相比對照組的情況，治療在4周和6周后改善了 DHI，且低劑量比高劑量的表現更好。沒有觀察到支架或損傷對照組的改善，而未損傷對照組的盤高度與第O周持平。
[0034]圖13A-B顯示了治療6周初步研究(Pilot Study)后的組織學評價。圖13A是健康、損傷、和處理過的椎間盤橫截面(蘇木精和伊紅染色，比例尺=2mm。圖13B示出處理后的IVD各種區域，包括骨髓、纖維環(AF)，軟骨終板(CEP)，和髓核(NP)經蘇木精和伊紅(H&E)，或阿爾辛藍染色后的組織學表現伊紅(比例尺=10um)。
[0035]圖14A-C顯示對豬進行初步治療的安全性和有效性(12周)。圖14A是顯示了相比損傷對照組，在12周內以持續方式改善DHI (p〈0.05)的IDCT劑量曲線圖；在支架或損傷對照組中沒有發現有改進，而未損傷對照組的椎間盤高度與第O周持平。圖14B是處理過程中豬脊椎的熒光鏡圖(注意在損傷盤中塌陷的椎間盤空間)。圖14C顯示了 IDCT治療的椎間盤組織學評價，包括髓核(NP)、軟骨終板(CEP)和纖維環(AF)，由蘇木精和伊紅(H&E)，或阿爾辛藍染色。
[0036]發明詳述
[0037]所述的椎間盤源性細胞是衍生自椎間盤組織的細胞，其可用于椎間盤的治療和/或修復。在某些情況下，椎間盤源性細胞可以在體外進行處理，以提供比其它細胞在修復、更換、或增加現有的或損壞的髓核組織更有效的椎間盤源性細胞。在許多實施例中，椎間盤源性細胞產生胞外基質。在一些實施例中，椎間盤源性細胞產生蛋白聚糖。在一些實施例中，椎間盤源性細胞產生膠原蛋白。在其他實施方式中，椎間盤源性細胞植入相鄰的天然細胞可有助于通過化學、機械或其它動因刺激天然細胞。例如，椎間盤細胞可分泌生長因子，細胞因子或其它蛋白質。
[0038]如本文所用，“椎間盤源性”是指能夠在體內產生椎間盤組織的能力。在一些實施方式中，椎間盤源性細胞能夠在體內使患病的或受損和/或喪失了椎間盤組織一種或多種性能的椎間盤組織得以重建。在一些情況下，“椎間盤源性”細胞可以在體外產生椎間盤組織，例如，椎間盤源性細胞可被用于生成用于植入的人造椎間盤。
[0039]如本文所用，當“維持”指在體外生長的細胞時，是指包括在培養基中生長了大于24小時的細胞。在一些情況下，維持細胞被劃分在細胞培養物內。
[0040]“微團(Micromass) ”是在抑制貼壁的圓錐形容器中，由約10，000至1，000, 000細胞聚集形成的，這導致細胞形成至少一個單一團。所述的微團可另外含有細胞外基質。它基于一個用于確定成軟骨潛力的檢測，并且也被稱為細胞團(pellet)。
[0041]當“約”用于本文中指可測量的值(例如一個量，時間持續時間等)時，是指小于約±20%的變化。在一些情況下，“約”指10%的變化或更小，或±5%的變化或更小。在一些情況下“約”可以指±1% -±0.