一步驟中，在鈣離子和磷脂最優量的存在下，通過因子IXa和它的輔因子(因子Villa)，將因子X活化為因子Xa。存在過量的因子X，使得因子X的活化速率僅取決于因子VIII的量。在第二步驟中，因子Xa水解生色底物以產生生色團，并且在405 nm光度測定讀取顏色強度。使用線性回歸統計方法計算未知物的效價，并且檢查測定的可靠性。活性以國際單位/mL (IU/mL)報道。關于因子VIII的生色和凝血測定的進一步細節可見于文獻(用于參考，參見:Barrowcliffe T.V.等人， seminars in Thrombosis and Hemostasis，28 (3)，2002; Lippi G.等人，Blood Coagulat1n and Fibrinolysis 2009，20 (1)，2009)o[0081 ] 此處報道的實驗的結果以相對單位給出。
[0082]超濾的培養收獲物
過濾15 L發酵的收獲液以去除細胞和碎片，然后通過使用100千道爾頓(kDa)截止膜的交叉流過濾濃縮40倍。
[0083]純化至UFDF
通過一系列層析步驟從超濾材料純化rFVIII，所述層析步驟包括通過使rFVIII結合至固定的單克隆抗體的免疫親和層析和離子交換層析，如Boedeker, Seminars inThrombosis and Hemostasis, 27 (4): 385-394 (2001)中所述。
[0084]QC 測定
為了分析產生的rFVIII蛋白的質量，應用一系列特定方法。針對完整性、糖基化模式和宿主細胞雜質的任何潛在變化評價FVIII產物的質量。
[0085]通過HPLC分析因子VIII完整性。還通過SDS-PAGE后的銀染色和通過使用抗FVIII抗體的蛋白質印跡分析產物的完整性和雜質。
[0086]為了測定污染物和雜質，使用特異性免疫測定分析產物的宿主細胞蛋白，且還分析產物的源自BHK細胞培養物的核酸雜質。
[0087]通過測定不同的糖組分和唾液酸化的程度分析分離的蛋白的糖基化模式。將數據與內部(in-house)的對照rFVIII蛋白進行比較。
[0088]關于實施例1-6的結束語
這些結果表明，可能通過在培養基中引入和/或增加甘露糖和/或鈣濃度實現>30%的滴度增益；滴度增益在連續灌注培養中持續>130天。重要地，產物質量屬性(包括雜質)或培養性能都不受培養基改變的影響。用葡萄糖沒有重現觀察到的對滴度增加的影響，例如，當僅僅增加不包括甘露糖的DMEM/F12中葡萄糖的濃度時。
[0089]使用15L灌注生物反應器，將甘露糖濃度從3 g/L增加至5 g/L可以使rhFVIII生產率增加超過25 %。獨立地，鈣從~1 mM增加至5 mM也導致生產率的幾乎相同的增益。并且當甘露糖和鈣兩者增加時，生產率增益進一步增加至接近40% ;與含有3 g/L甘露糖和ImM鈣的標準生產培養基相比，5 g/L甘露糖和5mM鈣的組合使得因子VIII比生產率增加>30%。細胞培養性能和產品質量屬性不受這種培養基制劑變化的影響。對生產率的影響在培養基切換后約一天內是明顯的，并且是可逆的。在連續灌注生物反應器細胞培養過程中，超過30 %的生產率增益從細胞庫解凍起持續超過3個月。
[0090]甘露糖和鈣對滴度增加的影響當采用兩者而非單獨采用每一種時更高。已知鈣穩定因子VIII分子。標準DMEM/F12 (1:1)培養基制劑中鈣的濃度為僅~1 mM。培養基制劑中鈣的較高水平因此可以幫助在過程中較早穩定因子VIII分子-早在當因子VIII被分泌到細胞之外時，而不是已經收集收獲物之后。
[0091]表1
如ATCC目錄中所述的DMEM:F-12 (1:1)培養基制劑 ATCC 目錄號 30-2006 無機鹽(g/升)
CaCl2 (無水)0.11665
CuS04(無水)0.0000008Fe (N03) 3.9H200.00005
FeS04.7H200.000417
MgS04 (無水)0.08495
KC10.3118
NaHC031.20000
NaCl7.00000
Na2HP04(無水)0.07100
NaH2P04.H200.06250
ZnS04.7H200.000432氨基酸(g/升)
L-丙氨酸0.00445
L-精氨酸.HC10.14750
L-天冬酰胺.H200.00750
L-天冬氨酸0.00665L-胱氨酸.HC1.H20 0.01756
L-胱氨酸.2HC10.03129
L-谷氨酸0.00735
L_谷氨酰胺0.36510
甘氨酸0.01875L-組氨酸.HC1.H20 0.03148
L-異亮氨酸0.05437
L-亮氨酸0.05895
L_ 賴氨酸-HC10.09135
L_甲硫氨酸0.01724
L-苯丙氨酸0.03548
L_脯氨酸0.01725
L-絲氨酸0.02625
L-蘇氛酸0.05355
L-色氨酸0.00902L-酪氨酸.2Na.2HzO 0.05582
L-纈氨酸0.05285維生素(g/升)
D-生物素0.0000036565
氯化膽堿0.00898
葉酸(λ 00265
肌醇0.01261
煙酰胺0.00202
D-泛酸0.00224(半f丐(hemicalcium)) 吡哆醇.Ηα0.00203
核黃素ο.00022
硫胺素.Ηα0.00217
維生素 Β-120.00068
其他(g/升)
D-葡萄糖3.15100
HEPES3.57480
次黃嘌呤0.00239
亞油酸0.000044
酚紅，
鈉鹽0.00810
腐胺.2Ηα0.00008
丙酮酸 *Na0.05500
DL-硫辛酸0.000105
胸苷0.000365。
[0092]本文所用的部分標題(sect1n headings)僅為組織性目的，而不應理解為以任何方式限制所描述的主題。
[0093]雖然本教導結合多種實施方案進行了描述，但不旨在本教導受限于此類實施方案。相反，本教導涵蓋多種替代方案、修飾、和等同方案，如本領域技術人員將理解的。
[0094]因此，應當在說明性而不是限制性意義上考慮本說明書和實施例。此外，本文引用的所有論文、書籍、專利申請和專利出于所有目的以其整體通過引用并入本文。
【主權項】
1.哺乳動物細胞培養基制劑，其包含約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5mM范圍內的鈣中的至少一者。2.權利要求1的制劑，其中所述培養基包含約3.5 g/L或更多的甘露糖和小于約1.5mM或大于約9.5 mM的I丐。3.權利要求1的制劑，其中所述培養基包含小于約3.5 g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣。4.權利要求1的制劑，其中所述培養基包含約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖。5.權利要求2的制劑，其中所述培養基包含約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖。6.權利要求1的制劑，其中所述培養基包含約2mM至約5 mM范圍內的鈣。7.權利要求3的制劑，其中所述培養基包含約2mM至約5 mM范圍內的鈣。8.權利要求1的制劑，其中所述制劑包含1:1比率的DMEM/F12且包括約4g/L至約5g/L范圍內的甘露糖和約2 mM至約5 mM范圍內的鈣中的至少一者。9.在細胞培養物中產生重組蛋白的方法，其包括: 提供表達重組蛋白的細胞；和 在細胞培養基中培養所述細胞，所述細胞培養基包括約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5mM至約9.5 mM范圍內的鈣中的至少一者。10.權利要求9的方法，其中所述培養基包含約3.5 g/L或更多的甘露糖和小于約1.5mM或大于約9.5 mM的I丐。11.權利要求9的方法，其中所述培養基包含小于約3.5 g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內的鈣。12.權利要求9的方法，其中所述培養基包含約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖。13.權利要求10的方法，其中所述培養基包含約4g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖。14.權利要求9的方法，其中所述培養基包含約2mM至約5 mM范圍內的鈣。15.權利要求11的方法，其中所述培養基包含約2mM至約5 mM范圍內的鈣。16.權利要求9的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。17.權利要求16的方法，其中所述哺乳動物細胞選自BHK細胞、CHO細胞、HKB細胞、HEK細胞和NS0細胞。18.權利要求17的方法，其中所述哺乳動物細胞是BHK細胞。19.權利要求9的方法，其中所述細胞表達凝血途徑重組蛋白。20.權利要求19的方法，其中所述細胞表達重組人因子VIII(rhFVIII)、或其變體。21.權利要求20的方法，其中所述變體因子VIII是遺傳變體。22.權利要求21的方法，其中所述遺傳變體是B結構域缺失的FVIII。23.權利要求20的方法，其中所述變體因子VIII是聚乙二醇化的FVIII。24.權利要求9的方法，其中所述細胞是表達重組因子VIII的BHK細胞，其中所述培養基包含1:1比率的DMEM/F12且包括約4 g/L至約5 g/L范圍內的甘露糖和約2 mM至約5mM范圍內的鈣中的至少一者。
【專利摘要】公開了增加重組蛋白的產生的制劑和方法以及其他方面。所述制劑和方法涉及在用于培養表達重組蛋白的細胞的細胞培養基制劑中增加甘露糖或鈣濃度、或兩者。在一些實施方案中，提供了具有約3.5？g/L或更多的甘露糖和約1.5？mM至約9.5？mM范圍內的鈣中的至少一者的哺乳動物細胞培養基制劑。提供了許多其他方面和/或實施方案。
【IPC分類】C07K14/755, C12N5/00
【公開號】CN105308174
【申請號】CN201480010579
【發明人】Y.希莫尼, V.默爾勒, V.斯里尼瓦桑, R.馬坦吉漢
【申請人】拜爾健康護理有限責任公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年2月25日
【公告號】CA2902170A1, EP2961827A1, US20160002592, WO2014134071A1