一套用于沙門氏菌檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一套生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一套用于沙門氏菌檢測 的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 隨著社會的進步和人民生活水平的提高，食品安全已經成為一個全球關注的焦點 問題，由各種食源性病原微生物引起的食物中毒事件，越來越多地引起專家和各國政府的 關注。及時有效地檢測和確定致病菌成為食源性疾病預防和治療的關鍵。沙門氏菌是一種 重要的食源性致病菌，由沙門氏菌引起的食物中毒事件在世界各國頻頻報道。2007年2月， 美國發生的"花生醬事件"，2005~2006年間，美國發生的"番茄事件"均是因沙門氏菌引 發。2006年盧森堡公國，沙門氏菌引起133人食物中毒，1人死亡。2005年6~10月之間， 澳大利亞塔斯馬尼亞州爆發了5次沙門氏菌引起的食物中毒，感染125人。2005年法國因 牛奶引起的沙門氏菌中毒事件，同時感染100多嬰兒。1990~2003年間西班牙加泰羅尼亞 地區，共爆發1078次食物中毒，其中因沙門氏菌引起為871次，14695人感染，1534人住院 治療，4人死亡，所占比例高達80.8%。在我國，細菌性食物中毒中有70%~80%是由沙門 氏菌引起的，以沙門氏菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的首位。由上可見，食品行業沙 門氏菌的檢測尤為重要。
[0003]現有沙門氏菌檢測方法主要為生化鑒定和PCR相關方法。生化鑒定方法耗時耗 力，而PCR方法和熒光定量PCR方法具有快速準確、敏感性強的特點，其中實時熒光定量PCR 以其特異性強、靈敏度高、速度快，在沙門氏菌檢測中得到廣泛應用。
[0004]質粒DNA標準物質是一套含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在 PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定 量分析的標準曲線。目前質粒DNA分子作為基因檢測的標準物質得到了越來越多的深入研 究和應用，但是針對沙門氏菌實時熒光PCR檢測方法的質粒DNA標準物質還是空白。在實 際沙門氏菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設計構建的質粒DNA分子作為標準品， 其中的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統一的定值方法，質粒DNA分子定值準確 度差，造成各實驗室之間的檢測結果差異極大，缺乏可比性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一套適用于沙門氏菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標準 分子及其應用。
[0006]本發明的另一目的是提供一套適用于沙門氏菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標 準分子及其應用。
[0007]本發明的第一方面，提供了一套分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含沙門氏菌編 碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的irwA基因序列和/或沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基 因序列。
[0008] 在另一優選例中，所述沙門氏菌invA基因基因序列選自下組：
[0009] (a)序列如SEQIDN0.:1所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列與SEQIDN0. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補并且長度為SEQID NO. :1所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0013] 在另一優選例中，所述沙門氏菌的sefA基因基因序列選自下組：
[0014] (a)序列如SEQIDN0. : 3所示的多核苷酸序列；
[0015] (b)核苷酸序列與SEQIDN0. :3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0016] (c)序列與SEQIDN0. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互補并且長度為SEQID NO. : 3所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0017] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0018] 在另一優選例中，所述多核苷酸含有沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白 的invA基因序列和沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基因序列，以及任選地連接兩種基因序 列的接頭序列。
[0019] 在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDN0. :3所示。
[0021] 本發明的第二方面，提供了一套分離的DNA構建物，所述DNA構建物中包含本發明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標簽序列、酶切序列、啟動子序列和/或載體序列。
[0022] 在另一優選例中，所述DNA構建物中包含沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面 蛋白的invA基因序列和沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0023] 在另一優選例中，所述DNA構建物為線性DNA構建物或環狀DNA構建物。
[0024] 在另一優選例中，所述DNA構建物為質粒或表達載體。
[0025] 在另一優選例中，所述的質粒或表達載體作為沙門氏菌檢測的標準分子（質粒標 準分子）。
[0026] 在另一優選例中，所述質粒或表達載體的骨架質粒選自下組：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0027] 在另一優選例中，所述質粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0028] 本發明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發明第一方面所述 的多核苷酸或者本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0029] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述引物對特異性擴增沙門氏菌 編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的invA基因序列。
[0030] 在另一優選例中，特異性擴增沙門氏菌invA基因序列的所述的引物對選自下組：
[0031]SEQIDN0. :5 和SEQIDN0. :6 所示的引物對；
[0032]SEQIDN0. :7 和SEQIDN0. :8 所示的引物對；
[0033]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物對；和
[0034]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物對。
[0035] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述引物對特異性擴增沙門氏菌 編碼鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0036] 在另一優選例中，特異性擴增沙門氏菌的sefA基因序列的引物對選自下組：
[0037]SEQIDN0. : 14 和SEQIDN0. : 15 所示的引物對；
[0038]SEQIDN0. : 16 和SEQIDN0. : 17 所示的引物對；和
[0039]SEQIDN0. : 18 和SEQIDN0. : 19 所示的引物對。
[0040] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDN0. : 13 所示。
[0041] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDΝα: 20 所示。
[0042] 本發明的第四方面，提供了如本發明第一方面所述的多核苷酸、本發明第二方面 所述的DNA構建物、或本發明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于沙門氏菌的 檢測。
[0043] 在另一優選例中，所述檢測為非診斷或治療目的。
[0044] 在另一優選例中，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
[0045] 本發明的第五方面，提供了一套沙門氏菌實時熒光定量PCR檢測方法，所采用的 標準物質是如本發明第一方面所述的多核苷酸或本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0046] 本發明的第六方面，提供了一套多核苷酸產品，所述產品包括：
[0047] (i)沙門氏菌標準品，所述的標準品選自：本發明第一方面所述的多核苷酸或者 本發明第二方面所述的DNA構建物；
[0048](ii)特異性擴增沙門氏菌序列的引物對，所述引物對為：
[0049]SEQIDN0. :5和SEQIDN0. :6所示的序列構成的引物對；和/或
[0050]SEQIDN0. : 14和SEQIDN0. : 15所示的序列構成的引物對。
[0051]在另一優選例中，所述的產品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨立的。
[0052] 在另一優選例中，所述的產品為試劑盒形式。
[0053] 本發明的第七方面，提供了一套沙門氏菌的質粒標準分子的制備方法，包括以下 步驟：
[0054] ①人工合成沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的in