用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于畜牧獸醫技術領域。更具體地，本發明涉及用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002]隨著我國動物飼料中抗生素的禁用，新型的綠色添加劑的開發成為熱點。目前益生菌制劑不斷發展，但是在其定性、定量檢測的方法還不夠科學和快速，這在一定程度上限制了益生菌制劑的發展。通常采用生理生化反應和選擇性培養基純培養分離計數的傳統方法，極易因為菌種差異導致的檢測效率受限、檢測結果不穩定，除此之外，傳統方法也會耗費大量的時間和資源。相對于PCR技術來說，是定性到定量的飛躍，因其特異性強、重復性好、準確和高效的特點成為分子生物學和微生物學領域非常重要的定量檢測方法。通過種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR技術，建立豬飼料中嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測方法，可以提高檢測效率、簡化檢測程序，并促進飼料行業和養殖業的發展，為益生菌和飼料產業的快速和長遠發展提供技術保障。
[0003]目前飼料中益生菌檢測存在的主要問題之一是飼料樣本的處理，飼料均是顆粒飼料，不同于含益生菌的液體產品，如益生菌發酵奶，采用什么方法可以使飼料中的益生菌釋放出來，而數量不會改變這是對飼料中益生菌檢測的難題之一，本課題組對經過反復實驗發現如果采用常規的粉碎、稀釋的方法，無法使飼料中的益生菌充分釋放；如果對飼料先進行粉碎，然后再溶于一定量的液體中進行振蕩，使益生菌充分釋放的話，振蕩時間過長，溫度過高，則飼料中的營養成份會使得益生菌大量的擴增，振蕩時間過短則菌液無法溶于液體中。鑒于此本發明將粉碎的飼料溶于一定量的溶液中，低溫(4°C )下振蕩1個小時后，對樣品進行梯度稀釋后，作為后續定性、定量檢測的樣本，誤差比較小。因為低溫的條件下振蕩一個小時，飼料中的益生菌既可以充分釋放，又不會大量擴增，所測得的益生菌的數目能否真實反應飼料中益生菌的添加量。飼料中益生菌進行定性、定量檢測是存在的另一個難題是目的基因的選擇，目前對微生物進行定性、定量檢測時大多數都是選擇高度保守的16sRNA基因作為目的基因，但是對已經報道的同一種微生物的基因組序列分析發現，同一種微生物含有的的16sRNA基因的拷貝數并不一致，如以大腸桿菌為例，目前報道的大腸桿菌的基因組中16sR ΝΑ基因的拷貝數從4到8不等，因此以16sRNA基因作為目的基因進行定量檢測時，16s RNA基因的拷貝數并不能真正的反應出微生物的菌落數，鑒于此本發明對目前已經報道的益生菌基因組序列進行系統的分析比對，選擇了序列保守的單拷貝基因作為目的基因來進行益生菌的檢測，這樣目的基因的拷貝數就可以真實的反應出微生物的菌落數。
[0004]本申請針對飼料中含有的嗜酸乳桿菌，通過對已經報道的嗜酸乳桿菌基因組序列的比對分析，選取嗜酸乳桿菌的保守基因作為目的基因，自行設計嗜酸乳桿菌的基因序列的種屬特異性引物，利用該引物進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立了豬飼料中嗜酸乳桿菌的快速定性和定量測定方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供了用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒，該試劑盒包括引物 5’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3，。
[0006]本發明的另一個目的在于提供了用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，方法簡單，重復性高，結果準確。
[0007]本發明的另一個目的在于提供了一種用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應用。
[0008]為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施:
[0009]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒，該試劑盒包括引物5’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’ 和 5’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。
[0010]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，包括飼料樣品預處理的方法，該方法包括:
[0011 ] 經過充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4°C以100轉/分的速度震蕩l_2h，配成10%的均勻稀釋液。對均勻稀釋液進行10倍遞增稀釋，選擇2個以上適宜的稀釋度，根據需要，提取細菌基因組DNA或RNA。
[0012]用于飼料中添加的嗜酸乳桿菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應用，其應用包括利用該試劑盒制備成用于嗜酸乳桿菌的檢測試劑，或利用該試劑盒進行嗜酸乳桿菌的定性檢測，或利用該試劑盒進行嗜酸乳桿菌的定量檢測，或利用該試劑盒同時進行嗜酸乳桿菌的定性和定量的檢測。
[0013]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0014](1)本發明所采用的飼料樣本的處理方法使得在益生菌的提取過程中，益生菌的擴增有限，同時飼料中的益生菌又可以充分釋放，這樣所測得值才能真實的反應出飼料中的益生菌數目，為一種特異的適用于飼料中嗜酸乳桿菌提取方法，為本發明首創。
[0015](2)本發明對目前已經報道的嗜酸乳桿菌及飼料中可能添加的如干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有的基因組序列進行了比對分析，選擇了保守的單拷貝基因作為目的基因，并以該基因的保守序列設計了特異性的引物，以該引物對飼料中的嗜酸乳桿菌進行定性、定量檢測，所得到數據才能真實的反應出飼料中添加的嗜酸乳桿菌的數量。
[0016](3)本發明可以在不進行益生菌純培養的基礎上，簡便、快速、準確地定性、定量檢測豬飼料中嗜酸乳桿菌，整個過程對飼料中嗜酸乳桿菌的檢測程序簡單、檢測效率高、準確性好，靈敏度高，最低檢測標準要比傳統的方法低的多，而且重復性好。
【附圖說明】
[0017]圖1為嗜酸乳桿菌的定性檢測示意圖。
[0018]其中泳道M:DL2000marker ；1:干酪乳桿菌；2:植物乳桿菌；3:保加利亞乳桿菌；4:屎腸球菌；
[0019]5:糞腸球菌；6:兩歧雙歧桿菌；7:動物雙歧桿菌；8:大腸桿菌；9:陽性對照(含有目的基因的質粒為模版)；10:嗜酸乳桿菌；11:添加有嗜酸乳桿菌的飼料；12陰性對照。
[0020]圖2為Real-time PCR對嗜酸乳桿菌引物特異性的驗證示意圖。
[0021]其中A.嗜酸乳桿菌B.植物乳桿菌C.保加利亞乳桿菌D.干酪乳桿菌E.糞腸球菌F.屎腸球菌G.雙歧桿菌H.青春雙歧桿菌。
[0022]圖3為不同濃度嗜酸乳桿菌標準菌種LA-14的擴增曲線示意圖。
[0023]其中A.10 1稀釋；B.10 2稀釋；C.10 3稀釋；D.10 4稀釋；E.10 5稀釋；F.10 6稀釋；G.10 7稀釋;Η.10 8稀釋。
[0024]圖4為嗜酸乳桿菌定量檢測標準曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0025]本發明實施例所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術。所用試劑或材料，均已公開。
[0026]pMD18-T克隆載體核DH5 α感受態細胞均購自Takara生物科技有限公司，Trizol試劑是由Invitrogen公司專供提取的RNA的產品；DNase I是TaKaRa公司產品；此過程中使用的氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑是天津市化學試劑三廠生產的產品。嗜酸乳桿菌標準菌種購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0027]實施例1:
[0028]嗜酸乳桿菌目的檢測基因的選取:
[0029]本發明對目前已經報道的嗜酸乳桿菌及飼料中可能添加的如干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、雙歧桿菌等其他益生菌所有的基因組序列進行了大量比對分析，選擇定性、定量檢測的目的基因，該目的基因在嗜酸乳桿菌基因組中是保守的看家基因，而且是單拷貝基因，以該基因的保守序列設計了特異性的引物，對飼料中的嗜酸乳桿菌進行定性、定量檢測，所得到數據才能真實的反應出飼料中添加的嗜酸乳桿菌的數量。針對該目的基因設計的引物為:5 ’ -CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3 ’和5 ’ -CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3 ’