一種檢測rs9263726等位基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和基因診斷領域，具體涉及一種檢測rs9263726等位基因的方法。
【背景技術】
[0002]當多種原因引起血液中尿酸濃度升高、細胞外液的尿酸鹽呈現超飽和時，就會發生高尿酸血癥，若尿酸鹽在機體組織中沉積造成進一步損害，則轉變為痛風，表現為患者關節活動受限、熱、痛、腫，伴有關節畸形、結節性痛風結石甚至腎臟病變，給痛風患者帶來極大痛苦(Smith et al.,2011)o高尿酸血癥和原發性痛風的發病率呈逐年上升趨勢。據統計，我國的高尿酸血癥患者人數已達1.2億，其中痛風患者超過7500萬人，并且正以每年9.7%的年增長率迅速增加，呈現出年輕化趨勢，痛風已經成為我國僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病(張心菊等，2014)。痛風的治療原則除了嚴格的低嘌呤飲食、戒酒之外，消炎止痛藥和控制尿酸藥物的使用也是必不可少的。
[0003]在痛風發病間期和慢性期，通常使用降尿酸藥物治療。2012年11月，美國風濕病學會(American College of Rheumatology, ACR)發布了最新的痛風指南(Khanna Det al.，2012)，其中“降尿酸藥物治療建議”中推薦將別嘌醇(Allopurinol)或非布索坦(Febuxostat)作為一線降尿酸用藥。鑒于非布索坦是2009年上市的新藥，雖然療效顯著，但其長期服用的安全性以及對4期及以上程度的慢性腎臟疾病患者的安全性尚未得到證實。而自上世紀六十年代起就推向臨床的別嘌醇價格低廉、療效明確，因此具有更好的應用前景。
[0004]別嘌醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過抑制該酶的活性，減少次黃嘌呤和黃嘌呤合成尿酸，從而減少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量減低到溶解度以下水平，防止尿酸形成結晶沉積在其他組織內，被廣泛用于痛風、高尿酸血癥的治療中，還可預防白血病、淋巴瘤或其他腫瘤在化療或放療后繼發組織內尿酸鹽沉積、腎結石，尤其適用于尿酸生成過多、對排尿酸藥過敏或無效，以及不宜使用排尿酸藥物(如有腎功能不全)的患者(Hamburger M et al.，2011)。但2%-5%患者服用別嘌醇后會發生皮膚反應(Hoskison TK et al.，2006)，雖然只有少于 I % 患者(Pluim H J et al., 1998 ；Kim S C et al., 2013)會轉變為包括 Stevens-Johnson 綜合征(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)和剝脫性皮炎在內的重癥藥疹，但是死亡率極高，其中SJS死亡率約5%，TEN死亡率約30-50% (Gerull R et al., 2011) 0 SJS表現為嚴重的多形性紅斑，可累及皮膚與粘膜，包括口、鼻、眼、陰道、尿道、胃腸道和下呼吸道粘膜，患者有失明之虞，可進一步發展形成TEN，全身黏膜潰爛，在紅斑上發生松弛性大泡或表皮剝離，若遇輕度觸碰或牽拉可導致表皮大面積剝離(Aubock&Fritsch, 1982 ；Arellano&Sacristan, 1993)。因此，目前別嘌醇在臨床上的使用面臨極大的醫療風險。
[0005]美國風濕病學會最新發布的2012痛風指南(Khanna D et al., 2012)中建議在HLA-B*5801分布頻率較高且與重癥藥疹關系密切的國家(如中國和韓國)，服用別嘌醇前需進行HLA-B*5801等位基因檢測，以作為別嘌醇誘發重癥藥疹的篩查指標，判斷該患者是否是別嘌呤醇所致重癥藥疹的高危人群。此項檢測的推出可以有效降低由別嘌醇引起的嚴重不良反應，讓痛風患者放心服用別嘌醇。但鑒于HLA-B多態性位點的復雜性，HLA-B*5801檢測方法操作繁瑣、干擾因素多，且可能由于罕見或未知HLA等位基因的干擾導致結果模棱兩可難以判讀。
[0006]2012年，日本學者Maekawa等人(Maekawa K et al.，2012)發現，PS0RS1C1 基因上的 rs9263726 等位基因(G>A)與 HLA_B*5801 呈現完全連鎖(r2= 1，D’ = I)，即 rs9263726基因型為GA或AA型的人群，必定為HLA-B*5801等位基因攜帶者，反之亦然。這個發現意味著可以使用rs9263726等位基因的基因型，替代HLA_B*5801成為別嘌醇誘發重癥藥疹的預測指標，進行別嘌醇的個體化用藥指導。
[0007]目前，篩查已知SNP常用檢測方法有TaqMan探針法、測序、基因芯片、限制性酶切片段長度多態性(RFLP)等多種技術。但各有缺點，如TaqMan探針法易受到待測位點周圍臨近的SNP位點的干擾，且價格昂貴；基因芯片不適宜小樣本、少數SNP位點的檢測；測序雖然是核苷酸檢測的金標準，但成本較高，周期長，不適合向臨床推廣；而RFLP僅能檢測有酶切位點的SNP，無酶切位點不能檢測，且要用到電泳方法，靈敏度有限，對環境有污染。
[0008]因此，迫切需要建立一種操作簡便、不受其他位點干擾的rs9263726檢測方法。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是建立一種快速、廉價、簡便、高特異性、不受臨近SNP位點干擾的rs9263726等位基因檢測方法。
[0010]本發明提供的rs9263726等位基因檢測方法，首先通過Sanger測序方法對大樣本中國健康人群的rs9263726等位基因上游200bp與下游200bp序列進行測序，構建該位點該區域內的多態性位點分布數據庫。測序發現位于PS0RS1C1基因的rs9263726位點(NG_021348.l:g.28892G>A)，其附近位置密布SNP和發生頻率較高的突變或缺失，包括已經被報道的 2 種 SNP 位點 rs3132557(NG_021348.l:g.28802T>C)和 rs9501057 (NG_021348.l:g.289090T)，以及尚未報道的 NG_021348.1: g.28852C>A、NG_021348.1: g.28999A>G、NG_021348.l:g.29036G>A、NG_021348.l:g.28900del C 和 NG_021348.l:g.28900 ins C共5種點突變和插入缺失突變。其中，最近的突變點距離待測位點rs9263726僅間隔7個堿基，且自待測點后第二個堿基起存在連續7個胞嘧啶(C)。這些特殊情況導致采用普通Taqman探針檢測rs9263726時，探針容易錯配，從而干擾正常檢測。并且若要達到區分rs9263726等位基因型是GG、GA還是AA型的目的，必須設計2條Taqman探針才能實現，增加了檢測量和檢測成本。本發明根據rs9263726周圍干擾位點分布特點，以HRM法為基礎，采用unlabeled probe探針，對待測位點進行精確區分，可做到既能準確辨別rs9263726的GG、GA和AA基因型，又能同時顯示鄰近干擾位點突變情況，并且整個反應僅使用了 I條探針進行I次擴增即可完成，方便、快捷，準確度高。
[0011]具體地，為了實現本發明的上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0012]—種檢測rs9263726等位基因的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0013]步驟一，從全血中抽提DNA ；
[0014]步驟二，以步驟一提取的DNA為樣本DNA進行不對稱PCR擴增；
[0015]步驟三，擴增結束后，加入熒光染料SYTO 9，在高分辨率PCR儀上檢測熔解溫度，分析溫度上升時樣本熒光信號的變化；
[0016]步驟四，對待測樣本rs9263726的基因型進行分析；
[0017]其中，所述步驟二中PCR擴增中的探針為:
[0018]5’ -CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PH0-3’
[0019]引物為:
[0020]上游引物:5，-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’
[0021]下游引物:5’ -GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3 ’。
[0022]為了優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括:
[0023]上述步驟二中PCR擴增反應體系優選為:10 μ I Premix Taq HS，2 μ M上游引物0.5 μ 1，10 μ M下游引物R 0.5 μ 1，探針0.5 μ I (10 μ Μ)，25ng樣本DNA，以及將體系總體積加至20 μ I的水。
[0024]上述步驟二中PCR擴增反應條件為:95 °C預變性2min，95 V 30s，55 V 30s，72°C 30s，50 個循環。
[0025]上述步驟三中的檢測恪解溫度的反應條件和操作優選為:95°C lmin，40°C Imin預處理后，熔解溫度從55°C升至90°C，每升高0.5°C采集一次數據，獲得高分辨率熔解曲線圖。
[0026]上述探針在3 ’端作磷酸化封閉。
[0027]本發明采用上述技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果:
[0028]本發明在PCR完成后再加入飽和熒光染料SYTO 9，放大擴增信號、減少熒光對PCR的抑制作用；本發明的方法根據大樣本測序發現的rs9263726周圍