一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的pcr-hrm引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是微生物檢測，分子診斷。具體涉及一種快 速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 雞白痢沙門氏菌（SalmonellaPullorum)屬于腸道桿菌科沙門氏菌屬，D血清 型中的一員。主要感染雞和火雞，臨床表表現以雛雞拉白色糊狀稀糞為特征，死亡率高。 Rettger于1899年首次報道了雞白痢沙門氏菌病，次年將本病命名為"雛雞致死性敗血 癥"1929年正式將本病命名為"雞白痢"。在所有飼養雞和火雞的地區均有本病的發生和存 在，在哺乳動物中，兔具有高度易感性，有人曾在豬體內分離到該菌，兒童亦偶有感染本病 的報道。目前，受沙門氏菌污染的家禽及相關產品已經成為人類沙門氏菌感染和食物中毒 的主要來源之一。另外，隨著養禽業的迅猛發展，雞白痢沙門氏菌病已成為家禽最總要的細 菌病之一，并列為國家規定凈化的細菌病，每年造成的經濟損失非常可觀。
[0003] 快速鑒別和診斷雞白痢沙門氏菌是凈化和防治的基礎，傳統的鑒定方法周期長、 靈敏度低、特異性差，如采集完樣品需要預增液BPW增菌（8~18h)，然后選擇性增菌液 (TTB、SC等）培養（18~24h)，再把增菌液接種到顯色平板上培養（18~24h)，接著挑 選可疑菌落進行生化鑒定及血清學鑒定（12~48h)。利用血清學診斷與雞傷寒沙門氏菌 (Salmonella Gallinarum)具有很高的交叉凝集反應性。另外，腸炎沙門菌（9,12:g，m:_) 的無動力變種（9,12因失去Η相（g，m)抗原表達能力而無法用診斷血清確認（g和m 因子），而純粹依據抗原式（9,12:-:-)則會誤判為雞白痢沙門氏菌，所以在國家提倡凈化 養殖場沙門氏菌的背景下，尋找一種高效、特異、快速的雞白痢沙門氏菌檢測方法具有重要 的公共衛生意義和經濟效益。
[0004] 高分辨率恪解曲線（high-resolutionmelting，HRM)是一種基于單核苷酸恪解 溫度不同而形成不同形態熔解曲線的基因分析新技術，具有極高的敏感性，可以檢測出單 個堿基的差異，SNP位點堿基不同會使雙鏈DNA的Tm值發生變化從而雙鏈DNA在升溫過程 中先后解開，形成不同的融解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強 度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響 熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。SYBR?GreenI 對PCR有抑制作用，必需使用低濃度；即使是高濃度也不能飽和插入DNA雙螺旋結構中的小 溝，非飽和態結合使染料在熔解過程中發生重排，染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位 點，造成熒光信號沒有變化，特異性下降。飽和染料在飽和濃度（熒光最大）下，也不會抑 制PCR;高濃度的染料飽和插入DNA雙螺旋結構中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會發生重 排，熔解曲線有更高的分辨率，飽和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、CYT09等。高分 辨率熔解曲線在病原菌檢測方面成本低、通量高、速度快、結果準確、不受檢測位點的局限， 實現了真正的閉管操作。在病原菌檢測方面有著巨大的應用前景。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種快速檢測雞白 痢沙門氏菌的PCR-HRM引物。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM方法。該方 法具有操作簡單、快速、特異性強、靈敏度高且高通量、低成本的特點，能夠廣泛的應用于獸 醫臨床檢測，為養殖廠雞白病沙門氏菌的凈化提供快速、尚效的方法。
[0007] 本發明的再一目的在于提供所述快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物的應 用。
[0008] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0009] -種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物rfbS-F:5^ -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3'或者其核苷酸的互補序列；
[0011] 下游引物rfbS-R:5' -CACAATTTATGAATACTGCATCHy或者其核苷酸互補序列。
[0012] -種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM方法，包括以下步驟：
[0013] A:提取細菌DNA;
[0014] B:以DNA為模板，利用上述所述的上游引物rfbS-F、下游引物rfbS-R和飽和熒光 染料進行擴增反應，獲得擴增產物；
[0015] C:對擴增產物進行HRM分析，確定是否為雞白痢沙門氏菌。
[0016] 進一步的，步驟B所述的PCR擴增反應體系為：
[0017]
[0018] 所述的飽和焚光染料優選為Eva green染料。
[0019] 所述的引物rfbS-F和引物rfbS-R的濃度各優選為lOnmol/μL;
[0020] 進一步的，步驟Β所述的擴增反應程序為：
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[0022] 進一步的，步驟C所述的HRM分析的具體分析過程為：以雞白痢沙門氏菌標準陽性 模板擴增后的熔解溫度Tm值為參考，待測樣品熔解溫度Tm值置信值（GCP)大于95%為雞 白痢沙門氏菌。
[0023] 所述的快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物可應用于雞白痢沙門氏菌的檢 測，養殖場雞白痢沙門氏菌的凈化，分子流行病學調查以及家禽養殖中雞白痢沙門氏菌的 風險評估。
[0024] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0025] (1)本發明首次建立了一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物并應用，其 操作方便，檢測時只需要在PCR反應中加入飽和熒光染料；簡化了臨床檢驗的流程并且大 大縮短了檢測時間，與傳統國標鑒定方法相比時間節省了 2/3 ;并且該方法具有高通量、低 成本的特點，一次最多可以檢驗384個樣本。
[0026] (2)與傳統PCR后電泳開放操作相比，本發明從PCR過程到HRM分析實現了真正的 閉管操作，整個過程PCR產物無需再轉入其他裝置，避免了交叉污染，并且可以完成定量分 析。
[0027] (3)本發明無需特異性的探針，無需測序，使用簡便，并且檢驗過程中不消耗PCR 產物，可以進一步進行下游分析。
[0028] (4)本發明特異性強，能夠很好的從腸炎沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌以及其他細 菌中區分雞白痢沙門氏菌，解決了傳統檢測方法鑒別雞白痢沙門氏菌準確率低的問題。本 發明靈敏度高，最低檢測下限能達到34個拷貝數每微升（yL)。在雞白痢沙門氏菌的快速 診斷中展示了廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1是雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌與雞傷寒沙門氏菌標準樣品HRM標準化熔 解曲線圖。
[0030] 圖2是雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌與雞傷寒沙門氏菌及其他細菌標準樣品 HRM峰型化熔解曲線圖。
[0031]圖3是特異性檢測及雞白痢沙門氏菌臨床樣品檢測峰型化熔解曲線圖。
[0032]圖4是雞白痢沙門氏菌靈敏度檢測峰型化熔解曲線圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0034] 實施例1引物
[0035] 根據NCBI已公布的沙門氏菌全基因組序列以及查閱相關資料發現雞白痢沙門氏 菌（SalmonellaPullorum)在rfbS基因上237有規律性的變化，所有雞白痢都為G，而雞傷 寒、腸炎等血清型為A，別的一些血清型和別的種類的菌株不含有該基因或者變化較大，固 可根據此位點設計特異擴增引物。
[0036] 采用01igo7引物設計軟件，根據GeneBank發布的沙門氏菌rfbS序列（雞白 痢沙門氏菌的rfbS序列的GeneBank登錄號：LK931482 ;雞傷寒沙門氏菌的rfbS序列 的GeneBank登錄號：AF442573 ;腸炎沙門氏菌rfbS序列的GeneBank登錄號：CP007267) 以及雞白痢沙門氏菌標準菌株測序獲得的rfbS序列（該rfbS序列與GeneBank登錄 號：LK931482中的相同），在rfbS基因237位點兩側設計引物對。上游引物rfbS-F: 5 ' -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3';下游引物rfbS-R:5 ' -CACAATTTATG