人類白細胞抗原基因分型的方法及其試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因分型的方法及其試劑，尤其涉及一種用于HLA-B、HLA-C位點5、6、 7外顯子基因分型的方法及其試劑。
【背景技術】
[0002] HLA復合體遺傳區位于人類第6號染色體短臂上，全長4000kb，其功能與免疫反 應有關。HLA分子遞呈抗原肽給T淋巴細胞識別，在適應免疫應答中起著極其重要的作用。 HLA基因也是人類極其重要的遺傳結構，在器官移植免疫排斥、司法鑒定等領域有著非常重 要的意義。HLA基因分為I類、II類和III類。HLA-B、-C位點屬I類基因。
[0003] 截至2014年7月，國際免疫遺傳頂GT/HLADatabase數據庫公布的HLA-B、-C位 點的等位基因分別為3455和2529個。HLA基因測序分型技術是HLA基因分型的"金標準"。 目前，HLA-SBT基因測序分型技術被業內公認為器官移植前和造血干細胞移植前HLA高分 辨配型的最佳方法。臨床實踐表明，HLA等位基因匹配程度起關鍵作用，是影響移植器官長 期預后的重要因素。隨著每個位點等位基因的數量逐年增多，模棱兩可結果的比例也隨之 增高，IMGT/HLADatabase中模棱兩可等位基因組合的統計數據充分證實了這點。從單個 HLA位點來看，HLA-B和-C位點的模棱兩可比例分別為91. 08%和97. 69%。
[0004]HLA模棱兩可等位基因組合形成的原理主要為兩種：（1)是某一等位基因常規檢 測區序列完全相同導致的，即差異堿基在常規檢測區外(常規檢測區外模棱兩可)；（2)由于 PCR產物的雜合性，有時不同等位基因的組合可得到相同的雜合子序列，即檢測區內雜合序 列一致(檢測區內模棱兩可)。
[0005] 長期在使用的商品化試劑盒（HLA-B和-C位點常規檢測區測序分型試劑盒，美國 AtriaGenetics公司）由于只提供了常規檢測區第2、3和4外顯子的正反向引物，故只能 檢測HLA-A、-B和-C位點常規檢測區即第2、3和4外顯子的堿基序列。差異堿基在常規檢 測區外的等位基因就成了模棱兩可基因。例如，008:01/08:22的差異堿基在HLA-C位點 的第6外顯子的1034堿基位上，因商品化試劑盒的常規檢測區測序并不包括第6外顯子的 測序，所以，008:01/08:22即成了模棱兩可基因。008:01和008:22均是中國人群CWD (常見及確定的)等位基因。在發放臨床移植配型報告時，必須將這兩個基因明確化。以往， 所采用的PCR-SSP(聚合酶鏈式反應-序列特異性引物）法，由于新等位基因被發現的速度 很快，商品化的PCR-SSP試劑的更新滯后，有的新等位基因可能不能被涵蓋和鑒定。而且， 某些陽性條帶不夠清楚或某些孔出現非特異性條帶容易引起誤判。因此，采用測序分型的 方法解決模棱兩可勢在必行。
【發明內容】
[0006] 為解決上述商品化試劑盒檢測結果模凌兩可的問題，本發明的目的是提供一種能 精確分型的人類白細胞抗原基因分型的方法。
[0007] 本發明的另一目的是提供該基因分型方法所用的試劑。
[0008] 為達到上述目的之一，本發明采用以下技術方案： 人類白細胞抗原基因分型的方法，包括以下步驟： (1) 用PCR擴增待檢測的基因組DNA的HLA-B和HLA-C位點基因； (2) 通過十二條測序引物對HLA-B和HLA-C擴增產物進行測序反應，確定基因型； 所述測序引物包括HLA-B外顯子5、6、7測序引物和HLA-C外顯子5、6、7測序引物；HLA-B外顯子5、6、7測序引物及核苷酸位置為： 第五外顯子正向測序引物B5F，其序列為：5'-GGGGATGAGGGGTCATATC-3'（SEQIDNo.1)，ntl851_ntl869; 第五外顯子反向測序引物B5R，其序列為：5'-TGCTGCWTCCCAGTAATGA-3'（SEQIDNo.2)，nt2134_nt2152; 第六外顯子正向測序引物B6F，其序列為：5'-AGGAGGTTCCTCTAAGATC-3'（SEQIDNo.3)，nt2424_nt2442; 第六外顯子反向測序引物B6R，其序列為：5'-TGTCGCTGSCTGGAGTAGA-3'（SEQIDNo.4)，nt2623_nt2641; 第七外顯子正向測序引物B7F，其序列為：5'-GGAGTGTGRAGGAGCTCAC-3'（SEQIDNo.5)，nt2543_nt2561; 第七外顯子反向測序引物B7R，其序列為：5 ' -CTCAGGCTACAGAAAACAAC-3 '（SEQIDNo.6)，nt2849_nt2868; HLA-C外顯子5、6、7測序引物及核苷酸位置為： 第五外顯子正向測序引物C5F，其序列為：5'-GGTCAGGGCTGAGGCTTGG-3'（SEQIDNo.7)，ntl926-ntl944 ; 第五外顯子反向測序引物C5R，其序列為：5 '-CCTGGGGCTTGAAACTCCC-3 '（SEQIDNo.8)，nt2145_nt2163 ; 第六外顯子正向測序引物C6F，其序列為：5'-TGGGGTCTGGGTTTTCTTG-3'（SEQIDNo.9)，nt2119_nt2137 ; 第六外顯子反向測序引物C6R，其序列為：5 ' -GGAGATGTGGGACAAGAGG-3 '（SEQIDNo.10)，nt2620_nt2638 ; 第七外顯子正向測序引物C7F，其序列為：5'-CCCACATCTCCTGCGGGCT-3'（SEQIDNo.11)，nt2628_nt2646; 第七外顯子反向測序引物C7R，其序列為：5' -CAGCTGTCTCAGGCTACAG-3'（SEQIDNo.12)，nt2885_nt2903。
[0009] 進一步地，步驟（2)所述HLA-B擴增產物有兩條產物片段，長度分別為1. 3kb和 1. 5kb〇
[0010] 進一步地，步驟（2)所述HLA-C擴增產物有兩條產物片段，長度分別為1. 3kb和 1. 5kb〇
[0011] 進一步地，步驟（2)所述測序反應的體系為： 測序引物（10pM) 0. 2yL DNA測序模板 2. 0μL 5XBigDye緩沖液 1· 875μL BigDye1· 1 或 3· 1 0. 5μL ddH20 5. 425μL〇
[0012] 進一步地，步驟（2)所述測序反應的循環參數為：96°C，20s;50°C，30s;60°C， 2min;25個循環后保持4°C。
[0013] 人類白細胞抗原基因分型的試劑，包括以下測序引物： HLA-B外顯子5、6、7測序引物： 第五外顯子正向測序引物B5F，其序列為：5' -GGGGATGAGGGGTCATATC-3' ； 第五外顯子反向測序引物B5R，其序列為：5' -TGCTGCWTCCCAGTAATGA-3' ； 第六外顯子正向測序引物B6F，其序列為：5' -AGGAGGTTCCTCTAAGATC-3' ； 第六外顯子反向測序引物B6R，其序列為：5' -TGTCGCTGSCTGGAGTAGA-3' ； 第七外顯子正向測序引物B7F，其序列為：5' -GGAGTGTGRAGGAGCTCAC-3' ； 第七外顯子反向測序引物B7R，其序列為：5' -CTCAGGCTACAGAAAACAAC-3' ； HLA-C外顯子5、6、7測序引物： 第五外顯子正向測序引物C5F，其序列為：5' -GGTCAGGGCTGAGGCTTGG-3' ； 第五外顯子反向測序引物C5R，其序列為：5' -CCTGGGGCTTGAAACTCCC-3' ； 第六外顯子正向測序引物C6F，其序列為：5' -TGGGGTCTGGGTTTTCTTG-3' ； 第六外顯子反向測序引物C6R，其序列為：5' -GGAGATGTGGGACAAGAGG-3' ； 第七外顯子正向測序引物C7F，其序列為：5' -CCCACATCTCCTGCGGGCT-3' ； 第七外顯子反向測序引物C7R，其序列為：5' -CAGCTGTCTCAGGCTACAG-3'。
[0014] 通過以上的引物可解決下表中常見的模棱兩可結果：
本發明具有以下有益效果： 本發明的檢測方法和試劑，有效擴增HLA-B，C位點的5、6、7外顯子，并對相應外顯子進 行測序，因此在進一步分型時，能夠解決當某幾個等位基因核苷酸位于擴增區域之外時無 法進行有效分型的問題，提高了HLA基因分型的分辨率和精確性。
[0015] 本發明通過加做非常規檢測區的外顯子測序，有效地解決了HLA高分辨基因分型 時出現越來越多的模棱兩可結果的問題。所獲得的序列中無背景信號和雜峰；可導入商品 化試劑配套的分析軟件中，易于識別和結果判讀。該方法適合于中國人群HLA-A、-B和-C 基因的高分辨水平基因分型，有助于HLAI類基因的臨床移植組織配型、群體遺傳學、人類 學及進化學等應用和基礎研究。
[0016] 本發明的引物均可與商品化試劑盒同步擴增和測序，提高工作效率，明顯降低試 劑成本，從而對提高檢測效率有著非常重要的意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1為HLA-B的第5~7外顯子正反向測序結果示意圖； 圖2為HLA-C的第5~7外顯子正反向測序結果示意圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明： 本發明的擴增和測序引物序列，委托大連寶生物公司合成。
[0019] 實施例1 從臨床移植配型樣本中隨機選擇了 150例HLA-B等位基因基因型已知的樣本。用本 發明的PCR引物和測序引物進行模棱兩可結果的測序分型，來驗證本發明分型方法的準確 性。
[0020] 首先，檢測HLA