人TERF1基因rs201882345位點多態性檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及測定單核巧酸多態性的方法。
【背景技術】
[0002] SNP(單核巧酸多態性）是指單個核巧酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式。基因多態性是個體與生俱來的遺傳特征，不隨環境發生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現，因此其應用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態性檢測在遺傳學領域和醫學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學現象。根據基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關系。應用于考古學中W確定古人類遺傳變異特征W及不同種群的親緣關 系。2.研究多態與種群親緣關系等遺傳學研究。多態亦與各種人體特征密切相關，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫學領域可W用于疾病預防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發現易于對某種毒物發生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態檢測，篩查出容易出 現血液毒性、神經毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學中可W用于藥物選擇W及劑量確定。通過多態檢測可W判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物W免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 端粒相關基因在保護端粒結構的完整性方面發揮著重要的作用。端粒重復序列結 合因子Htelomericr巧eatbindingfactor1，TERF1)主要負責調節端粒的長度，是端粒 酶的順式作用負調節因子，控制端粒的延伸。TERFl基因rs201882345位點多態，在人群中 存在兩種等位基因A和C，形成S種TERFl基因的基因型：AA型（人體基因組rs201882345 多態位點的兩個等位基因堿基均為A)，AC型（人體基因組rs201882345多態位點的兩個 等位基因堿基分別為A和C)和CC型（人體基因組rs201882345多態位點的兩個等位基因 堿基均為C)。 陽0化]聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態（PCR-RFL巧技術是一種快速、簡便、準確、 低成本測定SNP(單核巧酸多態性）基因型的經典方法。該方法通過引物來對模板進行擴 增反應，形成足夠數量和穩定的擴增產物，通過對擴增產物的酶切和檢測酶切產物的片段 長度，最終測定出SNP。TERFl基因rs201882345多態位點采取PCR-RFLP技術進行檢測，所 需內切酶為ApoI內切酶，其價格較昂貴，需要開發新的檢測技術。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的人TERFl基因rs201882345 位點多態性檢測的可靠手段。 陽007] 根據本發明的第一方面，提供了一種人TERFl基因rs201882345位點多態性的檢 測方法，包括：
[0008] 提供待測人基因組DM;
[0009] 提供擴增人TERFl基因rs201882345位點附近序列的上游引物和下游引物，其中 上游引物具有錯配堿基G;
[0010] W所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應W 獲得含GAATTM片段的擴增產物，其中M為人TERFl基因rs201882345位點上的待定堿基A 或C;
[0011] 提供限制性內切酶；
[0012] 利用限制性內切酶對所得擴增產物進行酶切（反應）W獲得相應的酶切產物；W 及
[0013] 根據所得酶切產物來確定人TERFl基因rs201882345位點上的待定堿基M是A還 是C， 陽014] 其中，限制性內切酶為僅能夠切開GAATTA片段與GAATTC片段之一的限制性內切 酶。
[0015] 根據本發明的實施例，在所得擴增產物上，上游引物的錯配堿基G與M之間相隔四 個堿基AATT。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現酶 切不充分等現象。并且，如此設置上游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈 敏度和特異度，運可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。
[0016] 在本發明的一個可選實施例中，在所得擴增產物上，上游引物末端堿基與多態位 點M相鄰。
[0017] 在本發明的一個優選實施例中，在所得擴增產物上，上游引物末端堿基不與多態 位點M相鄰。例如，上游引物末端可W是......GAAT、......GAA、......GA等結構。難W想象， 具有運種設計的上游引物竟然會進一步大大促進酶切反應，運可能與擴增結合力有某種關 聯。
[0018] 在本發明的一個優選實施例中，限制性內切酶可W采用僅能切開GAATTC片段的 EcoRI或其同裂酶。運類EcoRI酶價格低廉，能大大降低測定成本。
[0019] 根據本發明的實施例，所得酶切產物包括=種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產物、切斷后具有較長片段的擴增產物W及切斷后具有較短片段的擴增產物（通常 不能有效觀測到的）。通過觀測（判斷）酶切產物所包含的片段類型來確定人TERFl基因 rs201882345位點上的待定堿基是A還是C。例如，在采用EcoRI酶的情況下，根據總片段 和切斷后較長片段運兩個片段的觀察結果來進行判斷：如果觀察到酶切產物只有一種具有 總片段長度的未切斷擴增產物，則待定堿基為A;如果觀察到酶切產物只有一種具有較長 片段（小于總片段長度）的切斷產物，則待定堿基為C;如果觀察到上述二者，則待定堿基 既包括A又包括C。
[0020] 在本發明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。運種情況下，優選參照圖是擴增產物在 凝膠電泳標準設定時間后經紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產物。例如，本發明采用的參照圖是由合成 的189bp和137bp兩個堿基片段同時經凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規DNA ladder的復合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發明的 運種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產物所包含的片段類型，同時最大限度地避免 了誤判。酶切反應后優選將酶切產物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判 斷準確性。
[0021] 在本發明的優選實施例中，通過設計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產 物的總片段長度在IOObp至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優選長度 40~60bp(在該優選區間擴增反應尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段 長度的百分比超過20%。本發明的運種設計可W使得具有總片段長度的未切斷擴增產物 與切斷后具有較長片段的擴增產物的電泳紫外照片的位置區別顯著。但是，如果總片段過 長，則電泳位移將不明顯；過短則圖像會變的模糊一片，無法準確區分。上游引物的片段長 度范圍保證了PCR擴增反應能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現的擴增不足現象。 陽02引在本發明的優選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C之間，優選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應的特異性），使得設計的PCR產物純度 較高。本發明的運種設計可W使得PCR擴增產物條帶清楚，無雜帶出現，易于電泳切開。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難W區分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產物過少，影響觀察效果。
[0023] 在本發明的優選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優選時間15~3