一種檢測腎移植患者在術后感染巨細胞病毒危害程度的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于評估腎移植患者在術后感染巨細胞病毒所帶來不同危害程度的檢測方法。
【背景技術】
[0002]人類巨細胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一種人群中廣泛存在的DNA雙鏈病毒，是一種機會性病原體。在移植患者或其他應用免疫抑制劑的免疫缺陷患者，HCMV感染是最常見的感染。具有免疫力的個體初次感染HCMV通常是無癥狀的，但在移植患者中感染的嚴重性與免疫抑制的程度卻成正比，HCMV感染是腎移植患者最常見的病毒感染并發癥。
[0003]移植的實體器官是HCMV感染的主要器官，移植患者HCMV感染所引發的臨床癥狀分兩大類:直接效應(單核細胞增多樣綜合征或組織浸潤性疾病)和間接效應，當發生高HCMV血癥、免疫組化檢測證實病毒感染時，就要高度懷疑HCMV組織浸潤性疾病的發生。HCMV感染所致的間接效應是由于長期的病毒低水平復制，經直接的或免疫介導的損傷導致宿主免疫功能紊亂引起的臨床征象，包括免疫抑制和移植物排斥，進而影響移植物長期存活。
[0004]目前常用熒光定量PCR法擴增血漿、尿液等體液中HCMV DNA水平來監測HCMV病毒載量。國內以10，000拷貝/mL為閾值，高于此值時，認為患者體內有HCMV病毒高水平復制，處于HCMV感染活動期，需要抗病毒治療。國外則以30，000拷貝/mL為閾值。HCMV DNA拷貝數反映病毒的復制能力，T細胞功能主要反映機體對病毒的清除能力。從患者體液中HCMV DNA拷貝數、T細胞功能等方面來評估HCMV感染對移植患者的危害，由于缺乏HCMV病毒感染對B淋巴細胞免疫功能危害的評估，故而并不能比較全面地反映免疫功能狀態。
[0005]病毒載量檢測建立在病毒復制本身，即使是低水平復制、沒有癥狀，病毒復制仍可直接或間接導致一些并發癥，而不僅僅是器官損害。因此有利于指導預防性用藥。特異的免疫應答檢測建立在發生的并發癥和器官損害是與HCMV病相關，而不是HCMV復制，雖然說對于確實需要藥物治療的患者更有效，但是待檢測到與HCMV病相關的異常免疫應答時，其實已經處于被動的必須及時治療的狀態。腎移植患者HCMV感染后常常同時伴有非特異性和特異的免疫應答，體現者之一即是B淋巴細胞高反應活性狀態。
[0006]然而，個體情況不同的腎移植患者在感染同一 HCMV病毒情況下，對各自機體造成的危害并不相同。因此，如何很好地評估HCMV感染狀態以及對機體造成的危害程度，從而很好地防治HCMV感染是腎移植術后管理的重要目標。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是:提出一種用于模擬檢測不同腎移植患者在感染巨細胞病毒后反映⑶19+B淋巴細胞表型和生物學活性的方法。
[0008]本發明為解決上述技術問題提出的技術方案是:一種檢測腎移植患者在術后感染巨細胞病毒危害程度的方法，包括以下步驟:
[0009]a、采血，采集該腎移植患者的肝素鈉抗凝外周血20mL ;
[0010]b、⑶19+B淋巴細胞的獲取及分析，從淋巴細胞分離液中分離單個核細胞，以磁珠分選所述外周血中⑶19+B淋巴細胞；
[0011]c、制備人巨細胞病毒毒種和定量；
[0012]d、體外培養⑶19+B淋巴細胞并對其分別進行HCMV病毒的直接刺激和間接刺激；
[0013]e、流式檢測在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下BAFF受體在所述⑶19+B淋巴細胞上的表達，并獲得檢測結果；
[0014]f、檢測在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下⑶19+B淋巴細胞的凋亡率，并獲得檢測結果；
[0015]g、ELI SPOT法檢測在HCMV病毒的直接刺激和間接刺激條件下⑶19+B淋巴細胞分泌IgG的能力，并獲得檢測結果。
[0016]進一步的，所述步驟c中包括以下操作子步驟:
[0017]1、用含10% FBS的F12K完全培養基培養人肺成纖維細胞至長滿瓶底；
[0018]i1、棄培養基，PBS洗兩遍，加lmL病毒液，置于37°C、5% C02的培養箱中吸附病毒2小時；
[0019]ii1、棄掉病毒液，加含2% FBS的F12K維持培養基繼續培養；
[0020]iv、至細胞病變80%以上時收獲細胞；
[0021]V、_80°C和常溫反復凍融3次，382g離心lOmin取上清，分裝并保存至_80°C ；
[0022]v1、Reed-Muench法測定半數組織培養感染量。
[0023]進一步的，所述步驟d中包括以下操作子步驟:
[0024]1、獲得HCMV病毒直接刺激組，于六孔板中每孔加lmL 10倍無血清RPMI 1640培養基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的⑶19+B淋巴細胞，其中5 X 105細胞/孔，在37°C、5% 0)2培養箱中、每隔15分鐘搖勻一次、吸附2h，之后每孔再加lmL含20% FBS、2%雙抗的1640培養基混勻，于37°C、5% C02培養箱中繼續培養3天；
[0025]i1、獲得HCMV病毒間接刺激組，先將人肺成纖維細胞與⑶19+B淋巴細胞共培養，其中人肺成纖維細胞按2 X 105細胞/孔鋪6孔板，待細胞鋪滿板底，棄上清，每孔加lmLlO倍無血清F12K稀釋的HCMV AD-169病毒原液，37°C、5% C02培養箱中吸附病毒2小時，加2mL含胎牛血清的F12K維持培養基，繼續培養2天，棄上清，每孔加2mL1640完全培養基懸浮的⑶19+B淋巴細胞5X 105個，繼續培養5天。
[0026]本發明的有益效果是:
[0027]本發明中的檢測方法在患者尚未感染HCMV病毒之前，進行分析患者B淋巴細胞對HCMV病毒刺激的反應。如果患者B淋巴細胞在HCMV刺激后，細胞膜分子BAFF-R表達持續增高、BAFF信號阻斷使B淋巴細胞在HCMV刺激后凋亡率明顯增高時，認為患者如果感染HCMV后，B淋巴細胞將發生異常高反應活性。此時，患者發生慢性排斥的幾率大大提高，并且影響移植腎長期存活率。患者需要提前進行抗病毒治療，減少感染HCMV的風險，并考慮改變免疫抑制劑組合。
[0028]因此，本發明對于評估腎移植患者HCMV感染導致的慢性排斥這一間接效應具有重要價值。
【附圖說明】
[0029]下面結合附圖對本發明的檢測腎移植患者在術后感染巨細胞病毒危害程度的方法作進一步說明。
[0030]圖1是本發明中檢測腎移植患者在術后感染巨細胞病毒危害程度的方法的邏輯示意圖。
【具體實施方式】
[0031]實施例一
[0032]本實施例是針對甲腎移植患者在術后進行用于評估感染巨細胞病毒所帶來危害程度的檢測方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0033]步驟a、采血，采集甲腎移植患者的肝素鈉抗凝外周血20mL。
[0034]步驟b、⑶19+B淋巴細胞的獲取及分析，以淋巴細胞分離液(Ficoll)(購自天津灝洋生物公司)分離單個核細胞，以磁珠分選外周血中⑶19+B淋巴細胞。磁珠分選細胞包括以下子步驟:
[0035](1)取適量單個核細胞懸液，100g離心5分鐘，棄上清；
[0036](2)按每107個細胞加80 μ 1 MACS緩沖液，輕輕吹散細胞，混勻；
[0037](3)按每80 μ 1 MACS緩沖液加20 μ 1 CD19磁珠，混勻，4°C孵育15分鐘；
[0038](4)按每107個細胞加l-2mL MACS緩沖液混勻，100g，10分鐘離心，棄上清；
[0039](5)按每10s個細胞重懸于500 μ 1 MACS緩沖液中；
[0040](6)按照細胞數選擇LS柱和MidiMACS分離器，安裝好分選裝置(所需MACS分離柱和分離器根據細胞數選擇)；
[0041 ] (7)用MACS緩沖液潤濕分離柱，廢液缸收集廢液；
[0042](8)將(5)中所得細胞懸液緩慢加入分離柱中，標記的目的細胞滯留在柱子內，未標記的細胞則流出；
[0043](9)用3mL的MACS緩沖液清洗離心管3次；
[0044](10)從分離裝置上取下分離柱，置于目的細胞收集管上，加5mL MACS緩沖液，迅速洗脫目的細胞；
[0045](11)離心，棄上清，加培養基重懸備用，使細胞密度約為2 X105個/mL。
[0046]步驟c、人巨細胞病毒(HCMV AD-169)毒種(購自武漢大學病毒研究所)的制備，包括以下子步驟:
[0047](1)用含10% FBS(胎牛血清，下同)的F12K完全培養基培養人肺成纖維細胞(HFL-1)至長滿瓶底(90%左右)；
[0048](2)棄培養基，PBS(磷酸鹽緩沖液，下同)洗兩遍，加lmL病毒液，置于37°C、5%C02的培養箱中吸附病毒2小時；
[0049](3)棄掉病毒液，加含2% FBS的F12K維持培養基繼續培養；
[0050](4)至細胞病變80 %以上時(一般4-6d)收獲細胞；
[0051](5)-80°C和常溫反復凍融3次，382g離心lOmin取上清，分裝并保存至_80°C ；
[0052](6)Reed-Muench法測定半數組織培養感染量(Tissue culture infect1n dose，TCID50)。HCMV病毒感染HFL-1細胞致細胞病變，Reed-Muench法應用公式為:距離比例(PD)=(高于50%的死亡百分數-50%)/(高于50%的死亡百分數-低于50%的死亡百分數)，logTCID50 = log(高于50%的死亡百分數的稀釋度)+ (Η)Χ稀釋倍數)。
[0053]步驟d、⑶19+B淋巴細胞的HCMV病毒直接和間接刺激體外培養，將分選得到的CD19+B淋巴細胞進行體外培養，分別以HCMV病毒直接或間接刺激。觀察不同刺激因素下，⑶19+B淋巴細胞表型及細胞凋亡率的變化、以及分泌IgG水平的變化。
[0054]HCMV病毒直接刺激組:于六孔板中每孔加lmL 10倍無血清RPMI 1640培養基稀釋的HCMV AD-169病毒懸液懸浮的CD19+B淋巴細胞(5X 105細胞/孔)，37°C、5%