制備麥角硫因的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物資源、生物工程、發酵工程及天然產物的生物合成領域。更具體 地，本發明涉及一種W更高的產量制備麥角硫因的方法。
【背景技術】
[0002] 麥角硫因化-Ergothioneine,EGT)是一種稀有的天然手性氨基酸，作為生物體內 重要的生理活性物質，起著抗氧化，防止紫外福射損傷，調節細胞內的氧化還原反應，莖合 二價金屬離子，參與細胞內的能量調節等諸多生物學功能，是一種多功能的細胞生理保護 劑（劉埼，姜文俠，楊萍，周濤.麥角硫因一多功能的生理細胞保護劑[J].天然產物研究 與開發，2013, 25 (增刊）：160-164)。麥角硫因是通常認為安全的（generallyreco即ized assafe,GRA巧產品，性能穩定，在醫藥、生物醫學、食品、保健食品、食品添加劑和化妝品等 行業具有重要的應用價值和廣闊的應用前景。
[0003] 由于目前麥角硫因的制備成本高，限制了其應用。與化學合成法和天然生物提取 法相比，利用食用菌深層發酵制備麥角硫因，可W通過建立高強度發酵過程控制策略，提高 麥角硫因的積累量，實現大規模的高效生產，降低生產成本，而且具有產品安全等優勢，是 合成麥角硫因的發展方向（劉埼，張維亞，姜文俠，梅保良，周濤.麥角硫因生物合成技術的 研究進展[幻.2013年國際氨基酸產業發展高峰論壇論文集.2013 :22-27)。
[0004] 日本PramvadeeTepwong等利用香茹(Xentinulaedodes)菌絲體深層發酵制備麥 角硫因，發酵第15天時發酵液中麥角硫因的產量為23.6mg/L(PramvadeeTepwong,Anupam Giri,FumitoSasaki.Mycobialenhancementofergothioneinebysubmerged cultivationofediblemushroommyceliaanditsapplicationasanantioxidative compound[J] ?FoodQiemistry，2012, 131:247 - 258);韓國WiYoungLee等利用紫黑靈 芝（Ganodermaneo-japonicum)菌絲體發酵合成麥角硫因，發酵結束時發酵液中麥角硫 因白勺含量達 57. 5mg/L(WiYoungLee,Eung-JunPark,JinKwonAhn.Supplementationof methionineenhancedtheergothioneineaccumulationintheGanodermaneo-japonicum mycelia[J].ApplBiochemBiotechnol, 2009, 158:213-221);臺灣黃齡誼和QiiLh-Hung Liang對杏鮑茹巧Ieurotuseryngii)菌絲體進行液體發酵培養，培養結束后，發酵液 中麥角硫因的產量分別達62. 2mg/L(黃齡誼.高麥角硫因含量么杏鮑茹菌絲體深層培 養及其生理活性巧].臺灣：中興大學，2010)和60. 4mg/L(CMh-HungLiang，Ling-Yi Huang,Kung-JuiHo,etal.Submergedcultivationofmyceliumwithhighergothioneine contentfromtheculinary-medicinalkingoystermushroomPleurotuseryngii(higher basidiomycetes)anditscomposition[J].InternationalJournalofMedicinal Mushrooms, 2013, 15(2) :153-164);姜文俠等利用禮皮側耳巧Ieurotusostrea化s)菌絲 體發酵制備麥角硫因，通過對發酵培養基和發酵控制工藝的優化，發酵液中麥角硫因的含 量達到135. 7mg/L(姜文俠，劉埼，周濤.生產麥角硫因的菌株及制備麥角硫因的方法[P]. CN201210392417.8)。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是進一步提高中國發明專利申請CN201210392417.8中麥角硫因的 發酵產量，提供一種改進的制備麥角硫因的方法。將中國發明專利申請CN201210392417.8 的全部內容引入本文W供參考。
[0006] 在中國發明專利申請CN201210392417.8中，公開了一種制備麥角硫因的方法，包 括如下步驟：
[0007] 1)將糖皮側耳CGMCCNo. 6232的固體菌種（優選PDA斜面菌種）接種至液體種子 培養基，在19~3TC搖床100~20化pm培養至少3天，制備種子液；
[0008] 2)將種子液按4~20%的接種量（V/V)接種至發酵培養基，然后在19~3rC搖 床100~20化pm培養至少6天，得到糖皮側耳菌絲體發酵液；
[0009]3)發酵結束后，將菌絲體發酵液升溫至50~IOOC，W 0~60化pm攬拌浸提10~ lOOmin，麥角硫因從菌絲體的細胞內浸提到細胞外的發酵液中。
[0010] 所述的液體種子培養基的組成為；玉米粉15~50g/L(優選25~40g/L)、豆巧粉 10~35g/L(優選15~25g/L)、a-淀粉酶20~80U/L(優選30~65U/L)、磯酸二氨鐘 1~6g/L(優選2~4. 5g/L)、硫酸鎮0. 2~5g/L(優選0. 2~3g/L)，其余為水。
[0011] 所述的發酵培養基的組成為：甘油10~80旨/1，酪蛋白腺10~40g/l，磯酸二氨鐘 2~4g/l，硫酸鎮0. 5~2g/l，其余為水。
[0012] 本發明的巧術方案
[0013] 根據本發明，使用糖皮側耳（PleurotusostreaUis)TIB.BPE. 10010,作為發酵菌 種發酵制備麥角硫因。該菌種已于2012年6月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中必（簡稱CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCCNo. 6232。
[0014] 根據本發明進一步提高麥角硫因發酵產量的制備方法包括如下步驟：
[0015] (a)將糖皮側耳CGMCCNo. 6232的菌種接種至種子培養基，培養制備種子液，其中 所述種子培養基使用豆餅粉作為氮源；和
[0016] (b)將種子液接種至發酵基礎培養基，然后培養得到糖皮側耳菌絲體發酵液。
[0017] 優選地，糖皮側耳CGMCCNo. 6232獲自PDA斜面培養基；種子培養基為；玉米粉 15~50g/L(優選25~40g/L)、豆餅粉5~35g/L(優選15~35g/L)、a-淀粉酶20~ 80U/L(優選30~65U/L)、磯酸二氨鐘1~6g/L(優選2~4. 5g/L)、硫酸鎮0. 2~5g/L(優 選0. 2~3g/L)，其余為水；發酵基礎培養基為；甘油10~95g/L、酪蛋白腺10~80g/L、磯 酸二氨鐘2~4g/L、硫酸鎮0. 5~2g/l，其余為水。
[0018] 優選地，步驟（a)中的培養操作在19~3rC進行至少3天，步驟化）中的培養操 作在19~3rc進行至少6天，且步驟化）中的接種量為4~20 (V/V) %。
[0019] 進一步，向發酵基礎培養基中添加W下的任一種或多種物質：NH4CI、NH4NO3、葉酸、 維生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙麗酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜堿、組氨酸、半脫氨酸、 蛋氨酸、吐溫（tween,例如吐溫60和吐溫80)和司盤（span,例如司盤80)。該添加步驟可 W在發酵前或發酵的過程中進行。
[0020] 優選地，向發酵基礎培養基中添加W下量的任一種或多種物質；NH4CIO. 5g/L~ 12g/L、NH4NO3O. 5g/L~lOg/L、葉酸 0. 08g/L~2. 56g/L、VBlO.Olg/L~0.8g/L、剛巧了酸 0.Img/L~4mg/L、巧樣酸 0.Olg/L~0.8g/L、丙麗酸 0. 05g/L~4. 5g/L、谷氨酸IJimol/L~100ymol/L、天冬氨酸 0. 05g/L~9g/L、甜菜堿 50mmol/L~250mmol/L、組氨酸 0.Immol/L~3mmol/L、半脫氨酸 2mmol/L~45mmol/L、蛋氨酸 3mmol/L~45mmol/L、吐溫 0. 5g/L~50g/L(例如吐溫 602g/L~50g/L、吐溫 800. 5g/L~40g/L)和司盤 0. 2g/L~ lOg/L(例如司盤 800. 2g/L~lOg/L)。
[0021] 本發明的巧術效果
[0022] 使用豆餅粉作為糖皮側耳CGMCCNo. 6232發酵合成麥角硫因的種子培養基的 氮源，適當提高發酵培養基中甘油和酪蛋白腺的含量，向發酵基礎培養基中添加NH4CI、 NH4NO3、葉酸、維生素Bl(VBl)、剛巧了酸、巧樣酸、丙麗酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜堿、組氨 酸、半脫氨酸、蛋氨酸、吐溫和司盤中的任意一種或多種化合物，可顯著提高麥角硫因的發 酵水平，產物的產率比對照組大幅度提高。
【具體實施方式】
[0023] 本發明的W下實施例僅用來說明實現本發明的【具體實施方式】，送些實施方式不能 理解為是對本發明的限制。其它的任何在未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均視為等效的置換方式，落在本發明的保護范圍之內。
[0024] 實驗儀器、材料：搖床（IS-RDV3,美國精琪有限公司）；高效液相色譜儀 (Agilentl260,AgilentTechnologies);水浴鍋（TW20,Jul油O公司）；數字式加熱磁力攬 拌器（MIXControl20,WIGGENS公司）；電子分析天平（AB204-S，METTLERTOLEDO);活塞式 真空泉（V610,化emVak);超聲波清洗機（SB-5200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司）； 0.22um孔徑微孔濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）；中空纖維超濾膜（天津愛生膜過 濾技術有限公司）。
[00巧]主要試劑：麥角硫因對照品（純度>98%，BiomolInternationalInc.) ;PDA培養 基度ecton，DickinsonandCompany);甲醇等試劑為市售色譜純；磯酸二氨鐘、硫酸鎮、巧 樣酸購自國藥集團化學試劑有限公司；玉米粉購自梅河口市興達米業有限責任公司；豆餅 粉和豆巧粉購自北京中棉紫光生物科技有限公司；甘油購自天津市風船化學試劑科技有限 公司；酪蛋白腺購自偃師市百家工貿有限公司；NH4CLNH4NO3、丙麗酸和司盤80購自天津市 光復精細化工有