用于精煉微藻產生的角鯊烯的方法
【專利說明】用于精煉微藻產生的角響稀的方法
[0001] 本申請為國際申請日2013年4月15日、國際申請號PCT/FR2013/050812于2014 年10月16日進入中國國家階段、申請號201380020310. 3、發明名稱"用于精煉微藻產生的 角整締的方法"的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明設及用于精煉通過發酵產生的角整締的方法，該方法始于微生物，更具體 地始于微藻，甚至更具體地始于破囊壺菌目物種家族的那些。
[0003] 在本發明的意義，"破囊壺菌目物種家族的微藻"意指屬于物種裂殖壺菌屬物種、 Aurantiochytrium屬物種和破囊壺菌屬物種的微藻。
【背景技術】
[0004] 角整締是存在于所有高等生物中的一種脂質，并且是動物和植物醬醇激素W及一 些維生素（例如維生素D)的常見前體。 陽0化]它存在于許多細胞膜中，從而為它們提供流動性。
[0006] 運種不飽和直鏈控是具有=十個碳原子和五十個氨原子的類異戊二締，具有式： 2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六締，〔3。馬。，即它由6個全部處于 反式構象的異戊二締單元組成。
[0007] 像所有的祗締一樣，它是由異戊基焦憐酸醋形成，異戊基焦憐酸醋與二甲基締丙 基焦憐酸醋偶聯W相繼提供香葉基焦憐酸醋、然后是法呢基焦憐酸醋，在角整締合成酶的 作用下，兩個分子的法呢基焦憐酸醋在被NADPH還原后縮合W形成角整締。
[0008] 在植物和許多微生物中，運種途徑與其他代謝途徑共存，產生八氨番茄紅素，八氨 番茄紅素是葉綠素、類胡蘿h色素和膠乳中的祗締的前體。
[0009] 角整締及其在末端雙鍵處環氧化的衍生物擁有被轉化的特性，歸因于值得注意地 區域選擇性和立體選擇性地將酶（環化酶）特化到具有相當大的結構變異的多環=祗締： 真核生物中蕾締和里白醇的和原生動物中的四膜蟲醇（五環=祗締）；酵母、真菌和哺乳動 物中的羊毛醬醇和植物中的環羊毛醬醇（四環=祗締）。
[0010] 角整締的應用
[0011] 角整締一直被使用，尤其是在日本，作為食品補充劑。
[0012] 此外，是一個日本化學家，S丸辻本（MitsumaruTsujimoto)，在1906年發現了它 并在1916年確定它的結構。
[0013] 它被認為是一種有效的抗氧化劑，在天然藥物中具有許多有益特性。
[0014] 它的常規用途包括化妝品，雖然更常見地使用它的氨化的衍生物一-未被氧化的 角整燒，并因此不會變得腐臭。
[0015] 當具有高純度，結合刺激免疫系統的佐劑時，角整締已經并且現在仍然被用在某 些疫苗中：W"水包油"乳劑的形式，它充當表面活性劑，從而增加該疫苗的響應。
[0016] 它被用在祀向新出現的病毒（例如冊Nl和HlNl)的實驗性疫苗中，但尤其與季節 性流感的抗原相結合，用在自1997年W來給予的2200萬劑的組合物中（MF59,WlOmg/劑FLUAD蠻的比率），沒有嚴重接種后反應。
[0017] 目前對于某些不包含使免疫系統能夠采用適當的防御機制的信號的疫苗（滅活 或亞單位疫苗）來說，添加佐劑、角整締或侶鹽（自1926年W來使用的）是必要的。
[0018] 角整締避免了重復注射的需要W確保良好保護。
[0019] 角整締的運些用途加強了本領域的普通技術人員具有用于生產高純度的角整締 的安全方法的決屯、。
[0020] 此外，運種品質可W在醫學領域中開發其他應用路線。
[0021] 在未來，在某些癌癥或者在HIV類型的病毒性疾病的治療中，角整締與核巧類似 物的化學偶聯可能會因此構成一個相當大的進步。
[0022] 角整締的各種來源
[0023] 角整締常規地是從深海整魚肝臟中提取。
[0024] 然而，肝臟積累大量的有毒化合物，例如重金屬（包括隸）和其他脂溶性毒素。
[00巧]毒理學研究表明，按照在化妝品中使用的濃度，角整締及其氨化形式角整燒是無 毒的并且對人類皮膚無刺激或不致敏。
[00%] 然而，當用于醫學領域中，尤其是作為疫苗佐劑時，角整締的純度水平是至關重要 的。
[0027] 因此具有角整締的高品質、無雜質（痕量金屬，尤其是隸和其他毒素）是絕對有必 要的。
[0028] 除了從整魚肝提取外，在文獻中還提出了用于生產角整締的幾個路線。
[0029] 作為第一替代方案，它可W從橄攬油、棟桐油，W及從其他谷類油或來源于寬菜、 種子、米慷、W及小麥胚芽的油中分離。
[0030] 然而，此處的主要缺點是從運些提取的是極少量的角整締，大約0. 1到0. 7wt%， 并且需要很多費力的和昂貴的純化步驟。
[0031] 作為第二替代方案，首先提出了從微生物中生產角整締的方法，并且更具體地是 從天然酵母或重組酵母，尤其是酵母屬類型。 W巧 因此，已知釀酒酵母能夠生產角整締，但量很小：大約0. 〇41mg/g生物質 度HATTACHARJEE，P.(己特查爾吉，P.)等人，2001，WorldJ.Microb.Biotechnol.(《世界微 生物學和生物技術期刊》），17,第811-816頁）。
[0033] 因此通過基因重組嘗試了對運些生產的能力的優化。
[0034] 然而，如醫學領域（作為用于疫苗的佐劑的純度超過97%的角整締的生產）的專 利申請WO2010/023551所呈現的，只有超額生產（按超過15wt%干細胞計）角整締的重組 酵母是可用的，運種第一替代方案才可W工業應用。
[0035] 現在，獲得運些重組細胞需要應用大量費力、漫長而復雜的代謝工程步驟，通過采 用分子生物學的工具，導致對角整締生物合成途徑的刺激和對角整締分解代謝途徑的抑 制。
[0036] 事實上，如所述專利申請WO2010/023551另外回憶的，多個基因參與角整締的生 物合成：包括甲徑戊酸激酶、憐酸甲徑戊酸激酶、焦憐酸甲徑戊酸脫簇酶、焦憐酸異戊締醋 異構酶、HMGR(3-徑基-3-甲基戊二酷-CoA還原酶）和角整締合成酶。
[0037] 對于分解代謝途徑，編碼參與角整締至麥角醬醇轉變的眾多酶的基因包括：角整 締單加氧酶巧RG1)、羊毛醬醇合成酶、C14-二甲基化酶、dl4-還原酶、C4-甲基氧化酶、 C4-脫簇酶巧RG26)、3-酬還原酶、C24-甲基轉移酶、C8-異構酶、C5-脫飽和酶、d22-脫飽 和酶和d24-還原酶。
[0038]另外，還必須考慮到其他分解代謝酶：LEU2([e]-異丙基蘋果酸脫氨酶）、氧化角 整締環化酶、酵母醬醇-24-甲基轉移酶和麥角醬-5, 7, 24(28)-S締甘油醋-22-脫氨酶。
[0039] 作為從整魚肝臟中進行提取的方法的第=替代方案，提出了用于從尤其是 破囊壺菌目家族（包括破囊壺菌屬、Aurantiochytrium屬和裂殖壺菌屬），更特別地 Schizoc^triummangrovei或裂殖壺菌的微藻生產角整締的有前景的方法。 W40] 此外，運些微藻在異養條件下（無光；提供葡萄糖作為含碳源）生產角整締，并且 可W因此容易地由微生物發酵領域普通技術人員操作。
[0041] 然而在運些破囊壺菌目家族的微藻中，角整締是感興趣的其他脂類化合物的副產 物，例如二十二碳六締酸（或DHA)，《3家族的一種多不飽和脂肪酸。
[0042]因此看上去，角整締尤其被描述為DHA的商業油類（除胡蘿h素和醬醇類之外） 的不可皂化部分的組分之一。
[0043] 為了比較，Schizoch}ft;rium mangrovei的FBl菌株W按細胞干重的6. 2%的比率 生產DHA，對于角整締是0. 017%。 W44]因此，運些自然生產角整締的微生物W小量生產角整締：
[0045]-對于破囊壺菌ACEM6063 (參見LEWIS(劉易斯）等人，Mar.Biotechnol.(《海 洋生物技術》），2001，第439-447頁），大約0.Img/g生物質，
[0046]-對于Schizoch}ft;rium mangrovei FBl(參見JIANG(江）等人，J. Agric. Food 化6111.(《農業食品化學期刊》），2004,52，第1196-1200頁），大約0.162111旨/旨生物質。
[0047] 然而，通過發酵優化生產，運個領域的專家已成功地生產大約： |；0〇48] -Img至1. 2mg角整締/g破囊壺菌ACEM6063生物質（參見QianLi(錢李）等 人，J.Agric.FoodChem.(《農業食品化學期刊》），2009, 57,4267-4272或LEWIS(劉易斯） 等人，在Mar.Biotechnol(《海洋生物技術》），2001，3,439-447中）。 W例 -0. 72mg角整締/g裂殖壺菌屬生物質（參見G.C肥N(G.陳）等人，New Biotechnology(《新生物技術》），2010, 27-4,第 3