一種制備食品級海藻糖的黑曲霉工程菌的構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種制備食品級海藻糖的黑曲霉工程菌的構建方法與應用，特別設及 一種同源重組黑曲霉菌株生產麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合 酶制造海藻糖的方法，屬于基因工程和酶工程技術領域。
【背景技術】
[000引海藻糖是一種非還原性二糖，分子式是。2&2011 ? 2&0,廣泛分布于自然界中許多 生物細胞中，既是一種膽藏性糖類，又是應激代謝的重要產物。海藻糖不僅可W作為碳源和 能源，而且還具有保存生物活力的特殊功能，它具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、 干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環境條件下活性免遭破壞的功能。由于海藻 糖具有廣泛而獨特的生物學功能，廣泛受到各個國家的密切關注，W致引發了世界性的海 藻糖研究和開發熱潮。
[0003] 黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，又是重要的工業發酵微生物，在工 業酶制劑、有機酸發酵方面應用廣泛。可生產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄 糖氧化酶等超過30種酶制劑。因為黑曲霉出色的蛋白質分泌能力，黑曲霉也被開發為通用 的異源蛋白表達載體。黑曲霉具有強大的聚合物降解酶系，賦予其在各種廉價的培養基上 快速生長和發酵的能力，能夠在極低的抑下保持旺盛的代謝活性，因而不易染菌，能夠適 應工業發酵中粗放的物料和理化環境，運些品質使黑曲霉成為一種不可多得的工業生產宿 主菌，即細胞工廠。通過各種條件的優化，黑曲霉自身糖化酶產量甚至達到了30g/L。
[0004] 目前海藻糖的生產工藝主要有S種：
[000引 （1)提取法
[0006] 提取法主要通過培養海藻糖含量較高天然生物來獲取，目前主要的提取對象為酵 母（海藻糖含量約占酵母干重的15% )，但由于海藻糖屬于酵母內容物，提取時需要進行復 制的破壁及分離提取工藝，因此目前逐漸被酶法制備海藻糖法取代。
[0007] 似單酶法
[0008] 單酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶轉化麥芽 糖生產海藻糖的工藝。海藻糖合酶能夠將a,a-1，4-糖巧鍵連接的麥芽糖直接轉化為 a，a-1，1-糖巧鍵連接的海藻糖，該轉化反應不需要憐酸鹽的存在，不需要消耗高能物質， 但該方法所采用的酶熱穩定性一般較低，且轉化率多為60%左右，另外由于該酶同時具有 輕微的水解活性，因此單酶法轉化過程中還會產生少量副產物的葡萄糖。
[000引 做雙酶法
[0010] 雙酶法在1991年由Lama等人首次報道，即采用麥芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTOase)兩種酶利用淀粉為底物生產海藻糖的方 法。該方法中第一種酶用來催化聚合度值巧大于3的麥芽糊精，轉化其還原端的a-1,4 連接鍵生成a-1，1連接鍵。第二種酶專一性催化水解a-1，4鍵生成的a-1，1鍵海藻糖 和低分子量的麥芽低聚糖。目前雙酶法多數W還原性淀粉為原料，轉化率多為70-80%左 右，因此較單酶法相比更為經濟，除能夠生產海藻糖之外，還可W同時產生具有較高附加值 的麥芽=糖，因此該工藝路線已被用于工業化生產。
[0011] 雖然雙酶法具有W上諸多優點，但依然存在不足之處：雙酶法轉化所用兩種酶需 要分別進行發酵及純化才能獲取，因此酶的生產成本明顯高于單酶法。
【發明內容】
[0012] 本發明針對現有技術的不足，提供一種制備食品級海藻糖的黑曲霉工程菌的構建 方法與應用。
[0013] 本發明技術方案如下：
[0014] 一種制備食品級海藻糖的黑曲霉工程菌的構建方法，包括如下步驟：
[0015] (1)分別PCR擴增麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY與麥芽寡糖基海藻糖水解 酶基因TreZ,同時PCR擴增黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、 Gla3a;所述的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 ;所述 的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2;所述的黑曲霉糖 化酶基因的下游基因片段Gla3a的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3 ;
[0016] (2)采用重疊PCR技術，將步驟（1)制得的麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY與 麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因化eZ拼接，制得化eY-TreZ融合基因片段，TreY-化eZ融合 基因片段的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示W及氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示，然后將 步驟（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5與TreY-TreZ融合基因拼接，制得 GlaS-TreY-heZ片段，然后將黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3與GlaS-TreY-heZ 片段拼接，制得GlaS-TreY-heZ-GlaS片段；
[0017] 做將步驟似制得的GlaS-TreY-TreZ-GlaS片段與PMD18-TSimple連接，獲得 重組質粒pSimple-TreY-TreZ;將步驟（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a 與pMDlS-T載體連接，制得pMD-Gla3a質粒；
[001引 （4)用甜曰1、BamHI雙酶切載體PAN7-1，回收603化P的基因片段，甜曰1、BglII雙 酶切步驟（3)制得的pMD-Gla3a質粒，回收1213bp的基因片段，連接上述回收的基因片段， 構建載體pAN-Gla3a;
[001引 妨在Gla5基因上游引物5'端引入一個甜al位點，然后與pEASY-Blunt載體連 接，構建質粒載體祀ASY-GlaS;
[0020] (6)用限制性內切酶甜al、化〇1、化al;酶切步驟（4)制得的載體pAN-Gla3a，回 收3470bp的基因片段，化oI、SpeI雙酶切步驟（5)制得的質粒祀ASY-GlaS,回收3785bp的 基因片段，連接上述回收的基因片段，構建載體祀ASY-h地；
[00川 （7)用限制性內切酶甜al、化Ol雙酶切步驟（6)制得的載體祀ASY-h地和步驟（3) 制得的重組質粒pSimple-TreY-TreZ，回收7392bp與6367bp的基因片段，連接上述回收的 基因片段，構建載體祀ASY-TreY-heZ;
[002引 做用限制性內切酶甜aI、HindIII雙酶切步驟（7)制得的載體祀ASY-TreY-TreZ和載體PFGL59,回收983化P和7339bp的基因片段，連接上述回收的基因片段，制得 pFGL59-TreY-TreZ載體；
[002引 （9)將pFGL59-TreY-TreZ載體通過根癌農桿菌AGLl介導的黑曲霉轉化法轉化到 黑曲霉F0410中，經篩選，獲得制備食品級海藻糖的黑曲霉工程菌。
[0024] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY是W隧 尼古下節桿菌（Art虹obacternicotinovorans)基因組為模板，上游引物Fl和下游引物Rl為引物，通過PCR擴增獲得；
[00巧]F1:5，-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3'
[0026] R15' -CCTCGGGGGTGAACGTGC-3,；
[0027] 上述PCR體系為50 y 1 :
[0028] 2XHiFi-PCRmaster25yl;上游引物Fl2. 5yl;下游引物Rl2. 5yl;模板 2. 5yl;(1地2〇 17. 5yl;
[0029] 上述PCR程序如下：
[0030] 95°C變性 5min;95°C變性 30sec，62°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 個循環； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0031] 麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ是W隧尼古下節桿菌（Arthrobacter nicotinovorans)基因組為模板，上游引物F2和下游引物R2為引物，通過PCR擴增獲得；
[0032] F2:5，-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3，
[0033] R2:5 ' -GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3,
[0034] 上述PCR體系為50 y 1 :
[0035] 2XHiFi-PCRmaster25yl;上游引物F2 2. 5yl;下游引物R2 2. 5yl;模板 2. 5yl;(1地2〇 17. 5yl;
[0036] 上述PCR程序如下：
[0037] 95°C變性 5min;95°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 個循環； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0038] W黑曲霉基因組為模板，用Gla5重疊特異引物GlaS-F和GlaS-R-I進行PCR擴增， 擴增得到片段Gla5;
[0039] Gla5重疊特異引物如下：
[0040] GlaS-F: 5'-TCTAGACTCGGCGACTTGGTCTT-3'5' 引入甜al酶切位點
[0041] GlaS-R-I :5' -CGGTGTCAACACCATATTTGCCAACCCTGTGC-3'
[004引所述的PCR擴增體系為50 y 1:
[0043] 2XhqPCR MasterMix 25^1，IOymol/L上游引物GlaS-F 2. 5^1，IOymol/L下 游引物GlaS-R-I 2. 5yl，模板2. 5yl，用d地2〇 補足50yl;
[0044] 所述的PCR擴增程序如下：
[0045] 95°C預變性 5min;95°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 個循環； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0046] W黑曲霉基因組為模板，用Gla3重疊特異引物Gla3-F-1和Gla3-R進行PCR擴增， 擴增得到片段Gla3;
[0047] Gla3重疊特異引物如下：
[0048] Gla3-F-1 :5, -CAGGGTTGGCAAATATGGTGTTGACACCGMATCGACCTA-3'
[0049] Gla3-R :5, -ATGGATTGATTGTTCAGCCCAGGTCGACG-3'
[0050] 所述的PCR擴增體系為50 y 1 :
[0051] 2Xl'aqPCRMasterMix25y1，10ymol/L上游引物Gla3-F_l2. 5y1，10ymol/L 下游引物Gla3-R2. 5yl，模板2. 5yl，用d地2〇補足50yl;
[0052] 所述的PCR擴增程序如下：
[0053] 95°C預變性 5min;95°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 個循環； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0054]W黑曲霉基因組為模板，用Gla3a特異引物Gla3a-F和Gla3a-R進行PCR擴增，擴 增得到片段Gla3a;
[0055]Gla3a特異引物如下：
[0056]Gla3a-F:5' -AGATCTACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT-3' 5' 端引入BglII酶切位點
[0057]Gla3a-R:5' -TCTAGACATAAGGCGGGTTCACATCC-3'5' 端引入甜al酶切位點 [005引所述的PCR擴增體系為50y1 :
[0059] 2XhqPCRMasterMix25^1，IOymol/L上游引物Gla3a-F2. 5^1，IOymol/L 下游引物Gla3a-R2. 5yl，模板2. 5yl，用(1地2〇補足50yl;
[0060] 所述的PCR擴增程序如下：
[0061] 95°C預變性 5min;95°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 個循環； 72°C延伸lOmin，-20°C保存。
[0062] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中，采用重疊PCR技術制備TreY-TreZ融合基因 片段的條件如下：
[006引所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：
[0064] 95°C預變性 5min;95°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，5 個循環；
[006引所述的重疊PCR的初次擴增體系為：
[0066] TreY基因片段4yl;TreZ基因片段4yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;d地2〇 4. 5y1 ;
[0067] 所述的重疊PCR的補充擴增體系為25y1 :
[0068] 上游引物Fl2yl;下游引物R2 2yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;d地2〇 8. 5yl;
[0069] 所述的重疊PCR的補充擴增