表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型l1蛋白的重組質粒及其表達方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質粒、構建方法、 重組工程菌及其表達方法，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV)是一類雙鏈小分子DNA病毒，具有 嚴格的種屬特異性，主要感染人的皮膚和粘膜組織，引起相應部位上皮組織的增生性病變。 1977 年Lave;rty(Lave;rty,C.R. ,Russell,P.etal. 1977)在電鏡中觀察到宮頸癌組織中存 在HPV顆粒，1981 年，ZurHausen(HZiirHausen,etal. 1981)提出HPV可能與宮頸癌發病 有關的假設。此后，運一觀點被越來越多的實驗所證實。宮頸癌發病與人乳頭瘤病毒化uman papillomavirusJPV)感染有直接關系，采用靈敏的檢測方法，可W從幾乎100%的宮頸癌 患者病變組織中檢測到高危HPV-DNA。
[0003] 根據核酸序列同源性，目前發現的HPV約有200多種基因型，其中與人類生殖道感 染有關的有40多種，依致病性不同，可分為高危型和低危型兩類，HPV感染者發展為子宮頸 癌的幾率約0. 2%。其中宮頸癌患者中，約50~60%是由HPV-16感染引起（^dboomers J.M.etal.，1999)，在世界范圍內，HPV-16是與宮頸癌聯系最緊密的基因型，并隨地域變化 很小值oorbar，J. ,2005)。另外冊￥18、33、45、52和58與宮頸癌的發生高度相關。全球每 年有約50萬婦女患宮頸癌化OUtskyLA.etal.，1988)，其中約27萬因宮頸癌死亡（80% W上在發展中國家），宮頸癌發病率僅次于乳腺癌。
[0004] 因此，開發一種價格適宜、保護性良好的宮頸癌疫苗，特別是針對HPV-16的疫苗， 對于降低婦女宮頸癌發病和死亡率意義重大。
[0005]HPV基因組長約8化，分子量約為5XIO6道爾頓，直徑為50~60皿，正二十面體結 構。核屯、為單拷貝的基因組DNA，病毒衣殼由主要衣殼蛋白化1)和次要衣殼蛋白化2)組 成。其中，Ll蛋白是較大的衣殼蛋白，分子量為55-60kDa，為主要衣殼蛋白，是高度保守的 糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依據，同時體外表達的HPVLl蛋白可自組裝 成病毒樣顆粒（virus-Ukeparticle,VLP) (Kirnbauer,R.etal. , 1992)。L2 蛋白為次要 衣殼蛋白是高度可變核蛋白，反映HPV抗原的多態性（Wang,J.W.，Roden,R.B.，2013)。而且 在病毒殼粒中大多數L2蛋白在Ll蛋白內部，因此，在開發宮頸癌疫苗時，針對衣殼蛋白Ll 開發具有更好的針對性。
[0006] 根據現有研究結果，Ll基因是一個好的免疫預防祀。在細菌中表達的Ll蛋白或 使用疫苗載體的Ll蛋白用于免疫，可保護動物不受病毒感染。在酵母細胞及桿狀病毒表達 系統中表達HPVLl基因組裝成病毒樣顆粒（VLP)，該病毒樣顆粒已經用于誘導與保護免受 病毒侵襲有關的高效價病毒中和抗體應答。再者，VLP在形態學上與HPV毒粒完全相同，但 不含有潛在的病毒致癌基因，因此能誘導抗體應答而無感染或致癌危險性，在一定程度上， 能夠替代天然病毒，經免疫后可誘導產生型別特異性中和抗體，有效保護機體免受同型病 毒的感染或再感染，因此VLP是HPV疫苗試驗中最好的免疫原候選者之一。
[0007] 最早關于HPV衣殼蛋白裝配成VLP的研究是20世紀90年代用痘苗病毒表達系 統表達的HPV16Ll和L2蛋白狂houJ.et曰1.，1991)。Rose等用桿狀病毒表達系統成 功表達了HPVLl蛋白并自組裝成VLP(RoseR.C.et曰1.，1993)，專利W09420137(Rose R.C.etal.)公開了桿狀病毒表達系統制備LI蛋白及VLP。化fmann在釀酒酵母中表達了 HPV6aLlW及L1+L2蛋白，并觀察到了自組裝成的VLPOtofmannK.J.etal.，1995)，專利 W09531532〇tofmannK.J.etal.)公開了由酵母表達系統制備重組VLP化LL1+L2)的方法。 專利US5888516(Kat虹inU.Jansen，etal.)也在釀酒酵母中表達了HPV16Ll和L1+L2 并觀察到了自組裝成的VLP。
[0008]目前，有多家國外公司的HPV疫苗進入臨床實驗階段，其中包括DNA疫苗W及治療 性宮頸癌疫苗。其中由葛蘭素史克（GlaxoSmithKline,GSK)公司開發的有HPV16、18病 毒衣殼蛋白Ll在昆蟲細胞中自行組裝成的二價VLPs疫苗（商品名CcrvarixK嫂苗）及默克 (Merck)公司開發的是HPV6、11、16、18病毒衣殼蛋白Ll在酵母菌中組裝而成的四價VLPs 疫苗（商品名化地1川8=^苗）均已在國外上市。2014年12月10日，FDA官網宣布：Merck 公司研發的Gardasi!" 9巧價重組HPV疫苗）獲批。
[0009] 但是目前尚無利用Sumo標簽大腸桿菌系統中用于促進HPV16Ll表達及用于制 備宮頸癌疫苗的報道。
【發明內容】
[0010] 本發明所要解決的技術問題是提供一種表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白 的重組質粒、構建方法、重組工程菌及其表達方法，W提高HPV16Ll蛋白的可溶性、活性及 表達量。
[0011] 為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：一種表達可溶性人乳頭瘤病毒 16亞型Ll蛋白的重組質粒，將人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因和Sumo-tag標簽基因插入表 達載體中構建而成。
[0012] 所述重組質粒中Sumo-tag標簽基因3'末端與人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因5' 末端連接。
[0013] 所述重組質粒包括如SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列。
[0014] 所述Sumo-tag標簽基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0015] 所述人乳頭瘤病毒16亞型Ll基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0016] 本發明所采用的技術方案還在于提供一種表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋 白的重組質粒的構建方法，包括W下步驟：
[0017] (1)將Sumo標簽基因上游5'端引入限制性內切酶化OI酶切位點和6*化s-tag 基因，在下游3'端引入限制性內切酶BsaI酶切位點，得到Sumo-tag標簽基因；
[0018] (2)將Sumo-tag標簽基因和祀T-28a質粒分別用限制性內切酶化OI和BamHI 雙酶切，二者的酶切產物用T4DNA連接酶進行連接，得到重組質粒I;重組質粒I轉化大 腸桿菌感受態細胞JM109,涂布在KanaYLB固體培養基中培養，挑取單克隆接種于KanaYLB 液體培養基中培養，并進行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌落，提取陽性菌落質粒進行測序，測 序結果正確的，命名為重組質粒祀T28-Sumo ;
[0019] (3)設計合成人乳頭瘤病毒16亞型LI基因，裝入PUC57質粒中，根據基因序列設 計合成正向引物H-F、反向引物H-R，進行PCR擴增，PCR擴增產物用限制性內切核酸酶Bsa I和化OI雙酶切消化，備用；
[0020] (4)重組質粒祀T28-Sumo用限制性內切核酸酶BsaI和化OI雙酶切消化，備用；
[002。 妨將步驟做和（4)的雙酶切產物用T4DNA連接酶進行連接，得到重組質粒II; 重組質粒II轉化大腸桿菌感受態細胞JM109,涂布在KanaYLB固體培養基中培養，挑取單 克隆接種于Kana7LB液體培養基中培養，并進行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌落，提取陽性菌 落質粒進行測序，測序結果正確的，即為表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質 粒。
[002引所述正向引物H-F、反向引物H-R為：
[0023]H-F:5,-TTGGTCTCTAGGTATGTCTCTGTGGCTGCCG-3,；
[0024]H-R: 5' -AATCTCGAGTTACAGTTTACGTTTTTTACG-3，。
[00巧]本發明所采用的技術方案還在于提供一種包含表達可溶性人乳頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的重組質粒的重組工程菌，所述重組質粒的宿主為大腸桿菌化21 0E3)。
[0026] 本發明所采用的技術方案還在于提供一種所述重組工程菌誘導表達可溶性人乳 頭瘤病毒16亞型Ll蛋白的方法，包括W下步驟：
[0027] (1)將重組工程菌接種于Kana7LB液體培養基中培養至0〇45。值為0. 8時，加入 IPTG，使其終濃度為0. 3mM，然后于20°C誘導表達IOh;
[0028] (2)誘導表達結束后，離屯、收集菌體，清洗菌體，加入破菌緩沖液高壓破碎，離屯、， 收集上清液，純化即得。
[0029] 本發明所采用的技術方案還在于提供一種誘導表達的可溶性人乳頭瘤病毒16亞 型Ll蛋白在制備HPV疫苗方面的應用。
[0030] 本發明有益效果
[0031] (1)本發明對HPV16Ll基因進行優化，使其更適合在大腸桿菌宿主中高效率表 達目標蛋白，同時，本發明首次應用Sumo標簽表達系統在大腸桿菌中融合表達HPV16LI, Sumo標簽具有分子伴侶功能，能促進目的蛋白的正確折疊等特點，同時對熱和蛋白酶有很 強的抗性，有利于保持目的蛋白的穩定性，經實驗驗證HPV16Ll基因僅WHis標簽融合形 式在祀T28a載體中幾乎無目的蛋白表達，而本發明中與Sumo標簽融合表達時，目的蛋白的 可溶性有明顯增加，如圖3所示，可溶性目的蛋白含量約占到總蛋白含量的50%，經血凝實 驗證實其血凝價明顯提高，說明表達的可溶性目的蛋白具有更高活性。
[0032] (2)本發明的方法顯著提高了目的蛋白可溶性表達的效率，且產品性質均一、穩 定，發酵破菌液上清中的目的蛋白表達量可達到70yg/ml，運一數值明顯高于本發明目的 蛋白在其他原核表達系統中的產量，從而滿足工業化生產的要求。
[0033] (3)本發明在保證表達產物天然活性的前提下，經過發酵純化，得到自組裝成穩定 的病毒樣顆粒（VL巧的HPV16Ll蛋白。實驗表明，純化的VLP能使小鼠產生較高滴度的抗 體，并通過血凝抑制試驗化I)和假病毒中和實驗證明其具備中和活性。W上實驗結果說 明，通過大腸桿菌病毒樣顆粒技術平臺制備的HPVl化1VLP能用于生產預防宮頸癌的疫苗。
[0034] (4)本發明提供了一種原核表達可