小鼠crabp2基因真核表達載體的構建及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種載體構建方法，具體地說是一種小鼠CRABP2基因真核表達載體 的構建及應用。
【背景技術】
[0002] 維生素A是人體生長發育及維持機體生命活動所不可或缺的一種微量營養素，它 除了在細胞分化方面具有明確的作用W外，同時還參與如免疫反應、食欲和生長等許多其 它生理生化過程。其中，其活性代謝物視黃酸通過調節許多目標基因的轉錄來調節細胞分 化和增殖等許多生理生化過程，但要充分發揮此功能必須和相應的蛋白相結合，即細胞視 黃酸結合蛋白（CRABPs)基因家族。
[0003] Tang等研究發現，CRABPs基因家族在豬胚胎發育不同時期的骨骼肌里呈現差異 表達，而CRAPB2是CRABPs基因家族的一名成員。早期研究發現，在小鼠胚胎發育時期，該 基因在多個組織器官都有表達，CRAPB2基因在胚胎發育過程中發揮重要作用，同時可能對 肌肉發育起調控作用，而小鼠來源的骨骼肌細胞系C2C12,是用作研究體外肌細胞分化和肌 肉發育常用的一種重要細胞模型。
[0004] 在細胞水平上研究證明CRABP2基因參與骨骼肌的肌纖維分化和肌肉發育，首先 需要研究CRABP2基因對C2C12細胞的作用，因此構建小鼠CRABP2基因的真核表達載體至 關重要。
【發明內容】
陽0化]為了解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種小鼠CRABP2基因真核表達載 體的構建W及該表達載體的應用。
[0006] 一種小鼠CRABP2基因真核表達載體的構建，包括W下步驟：
[0007](1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉組織中的總RNA，合成CDNA第一鏈后，W合成的 CDNA第一鏈為模板進行擴增，獲得CRABP2基因；
[000引 似、將步驟（1)中擴增后獲得的產物克隆到pGEM-Teasy載體，挑選陽性重組子 測序，獲得基因序列SEQIDN0:1，將測序獲得的陽性重組子命名為PGEM-T-CRABP2;
[0009] (3)、將步驟似中的陽性重組子PGEM-T-CRABP2與真核表達載體PCDNA3. 1 (+)連 接、轉化，得到小鼠CRABP2真核表達載體PCDNA3. 1-CRABP2的重組質粒。
[0010] 優選地，所述步驟（1)擴增是采用RT-PCR擴增技術，且擴增CRABP2基因時，設計 1對引物如下： 陽011 ]上游引物：5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0012] 下游引物：5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。
[0013] 優選地，兩條所述引物的5'端分別加上EcoRV和NotI內切酶的酶切位點。
[0014] 優選地，將獲得的CRABP2基因置于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳、檢測后于紫外儀下切 割目的片段并使用凝膠回收試劑盒回收，回收產物克隆到pGEM-Teasy載體。 陽O巧]優選地，所述步驟（3)，陽性重組子PGEM-T-CRABP2與真核表達載體PCDNA3. 1 (+) 分別經限制性內切酶EcoRV和NotI雙酶切進行連接后，轉化至大腸桿菌D冊a感受態細 胞，通過抗性基因序列篩選，將陽性克隆采用PCR和測序鑒定后，獲得小鼠CRABP2真核表達 載體PCDNA3. 1-CRABP2的重組質粒。
[0016] 優選地，所述抗性基因序列是PCDNA3. 1(+)載體所包含的Amp抗性基因序列。
[0017] 一種小鼠CRABP2基因真核表達載體的應用，用于研究CRABP2基因在肌肉發育中 的調控作用。 陽01引優選地，小鼠CRABP2基因真核表達載體的應用，包括如下步驟：
[0019] (1)、從所述小鼠CRABP2基因真核表達載體中挑選正確克隆的陽性菌株擴大培 養，提取無內毒素質粒；
[0020] (2)、將步驟（1)獲得的無內毒素質粒轉染至C2C12細胞，于37°C培養4-化后棄去 轉染混合液，加入含血清的DMEM生長培養基繼續在37 °C溫度條件，C〇2為5%的培養箱內進 行培養；
[0021] (3)、轉染達3天后，收集細胞抽提RNA后驗證分析小鼠CRABP2基因在C2C12細胞 中的表達情況。
[0022] 優選地，所述步驟（2)中，細胞融合度達到60% -70%時進行轉染。
[0023] 本發明一種小鼠CRABP2基因真核表達載體的構建及應用，優點是：利用一對引物 進行PCR擴增，克隆得到小鼠CRABP2基因的完整編碼區，并成功構建小鼠CRABP2基因真核 表達載體。該真核表達載體構建方法簡單易行；驗證CRABP2基因在轉染后C2C12細胞中的 表達，為研究該基因在肌肉發育中的作用奠定基礎，同時為將來運用于遺傳標記輔助育種 提供重要依據。
【附圖說明】
[0024] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明： 陽02引圖1為本發明所述CRABP2基因的RT-PCR擴增圖； 陽0%] 圖中：M為10化PMarker, 1-5為PCR產物，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析得到 512bp的條帶，與預期目的片段大小一致；
[0027] 圖2為本發明所述的載體酶切鑒定圖；
[0028] 圖中：M為1000 bpMarker,
[0029] 1為限制性內切酶EcoRV和NotI雙酶切PGEM-T-CRABP2重組質粒雙酶切后，出現 兩條片段，約SOObp和3000bp，酶切片段大小與預期值相符；
[0030] 2為限制性內切酶EcoRV和Not I雙酶切PCDNA3. 1(+)質粒；
[0031] 圖3為本發明所述重組質粒的陽性克隆測序圖；
[0032] 圖4為本發明重組質粒的陽性克隆測序與基因序列比對結果； 陽03引圖5為本發明所述的PCDNA3. 1-CRABP2載體瞬時轉染C2C12細胞后Real time PCR 檢測分析圖。
【具體實施方式】
[0034] 本發明一種小鼠CRABP2基因真核表達載體的構建及鑒定的原理是：將CRABP2 基因T-A克隆到pGEM-T easy載體上，再通過亞克隆的方法定向插入到真核表達載體PCDNA3. 1(+)中，然后將獲得的表達載體瞬時轉染至小鼠骨骼肌C2C12細胞系，驗證CRABP2 基因轉染后在C2C12細胞中的表達。
[0035](一）一種小鼠CRABP2基因真核表達載體的構建與鑒定，包括W下步驟：
[0036] (1)、TRIzol法提取總RNA:用研鉢磨碎小鼠肌肉組織樣品，每50-lOOmg組織加入 Iml裂解液，PBS漂洗細胞后，加入ImlTRIzol試劑（購自invitrogen公司），吹打混勻， 移入1. 5mlEP管中，然后加入氯仿抽提，用75%的乙醇充分洗涂沉淀，離屯、后去上清，干燥 后用DEPC水溶解，-70°C保存備用；
[0037] 似、CDNA第一鏈的合成：取步驟（1)中獲得的總RNA采用反轉錄試劑盒反轉錄合 成第一鏈cDNA;例如：20y1反應體系中加入5y1RNA溶液、1y1OligoUy1dNTP，65°C 反應 5min，迅速放冰上冷卻；再加入 4]i化UfferJy1DTT、1Ji1foiaseinhibitor, 37°C反 應2min后加入IyI逆轉錄酶，37°C反應60min;80°C15min終止反應，得到cDNA，于-20°C 冰箱保存；
[0038](3)、目的基因片段的體外擴增及純化
[0039] 將步驟似中獲得的第一鏈CDNA作為模板，采用RT-PCR擴增技術，獲得CRABP2 基因，然后將CRABP2基因置于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳、檢測，于紫外儀下切割目的片段并使 用凝膠回收試劑盒回收（如圖1);
[0040] 擴增CRABP2基因時，應用PrimerPremier5.0軟件設計引物對：上游引物： 5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
[0041]下游引物：5' CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT 3'
[0042] 同時在兩條引物5'端分別加上EcoRV和NotI內切酶的酶切位點；PCR反應總體 積為 20yL，其中含 10Xbuffer(Mg2〇，75ymol/L的dNTP，0. 3ymol/L的引物，1.OULATaq DNA聚合酶，cDNA模板為50ng;PCR擴增程序是：95°C5min預變性，95°C30s變性，ere30s 進行退火，然后72°C延伸30s，共進行30個循環，最后72°C延伸5min。
[0043](4)、小鼠CRABP2基因真核表達質粒構建
[0044] ①、將步驟（3)純化PCR產物與pGEM-Teasy載體（購自Promega公司）連接， 連接