一種干擾素A2b與膠原結合結構域的融合蛋白及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體設及一種干擾素A化與膠原結合結構域的融合蛋 白及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 干擾素（Interferon,IFN)是細胞因子的一類，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等 生物活性。干擾素有多個亞型，！型干擾素包括IFN-O(IFNA)、IFN-P，II型干擾素包括 IFN- 丫，III型干擾素包括IFN-A。在抗腫瘤治療中，臨床常用是IFNA2a和IFNA2b，它們 的一級結構僅差異1個氨基酸。在臨床上，IFNA用于治療諸如毛細胞白血病、黑色素瘤、濾 泡性淋己瘤、腎細胞瘤等腫瘤。IFNA發揮抗增殖活性包括直接作用和間接作用，直接作用通 過JAK-STAT信號轉導通路導致細胞周期停滯、細胞壞死或細胞分化，間接作用則通過活化 免疫細胞，如淋己T細胞、自然殺傷細胞，抑制血管新生和誘導其他細胞因子表達。
[000引 目前，IFNA化通常采用皮下、肌內、靜脈給藥，但蛋白注射后很快隨體液擴散而使 得局部濃度很難達到治療要求，如果大量注射則會對生物體產生負作用，而反復較低劑量 給藥給患者帶來不便和痛苦。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述問題，本發明提供了一種干擾素A化與膠原結合結構域的融合蛋 白，其可W特異結合在腫瘤組織上。 陽0化]本發明提供了一種SEQIDNO:1~3任意一項所示的核巧酸序列。
[0006]SEQIDNO:1所示的核巧酸序列含552個核巧酸，其中，第1-498位為IFNA的編 碼序列，第499-531位為連接膚的編碼序列；第532-552位為膠原結合結構域（CBD)的編碼 序列。 陽007] SEQIDNO:2所示的核巧酸序列含558個核巧酸，除了包含SEQIDNO:1所示序 列W外，還包含連接膚的編碼序列（第553-558位），該序列編碼連接膚，用于連接C抓與組 氨酸標簽。
[0008] SEQIDNO:3所示的核巧酸序列含579個核巧酸，除了包含SEQIDNO:2所示序 列W外，還包含編碼組氨酸標簽的核巧酸序列（第559-576位）W及終止密碼子，添加編碼 組氨酸標簽的核巧酸序列是為了方便純化。
[0009] 本發明還提供了一種重組載體，它包含SEQIDNO:1~3任意一項所示的核巧酸 序列。優選地，所述的重組載體是重組祀T28a質粒。
[0010] 本發明還提供了一種重組菌或轉基因細胞系，它包含前述的重組載體。優選地，所 述的重組菌為重組大腸桿菌。
[0011] 本發明干擾素A2b與膠原結合結構域的融合蛋白，它是由SEQIDNO:1~3任意 一項所示的核巧酸序列編碼。優選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4~6任 意一項所示。
[0012]SEQIDNO:4所示的的蛋白包括184個氨基酸，其由SEQIDNO:1編碼，其中，第 1-166位為IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第1-498位核巧酸編碼；第167-177位 連接膚的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第499-531位核巧酸編碼；第178-184位為膠原結 合結構域（CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO:1中第532-552位核巧酸編碼。 陽01引 SEQIDNO:5所示的的蛋白包括186個氨基酸，除了含有SEQIDNO:4所示的氨 基酸W外，還含有兩個氨基酸組成的連接膚，其由SEQIDNO:2編碼，其中，第1-166位為IFNA的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第1-498位核巧酸編碼；第167-177位連接膚的氨 基酸序列，由SEQIDNO:2中第499-531位核巧酸編碼；第178-184位為膠原結合結構域 (CBD)的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第532-552位核巧酸編碼；第185-186位為連接膚 的氨基酸序列，由SEQIDNO:2中第553-558位核巧酸編碼。
[0014]SEQIDNO:6所示的的蛋白包括192個氨基酸，除了含有SEQIDNO:5所示的氨基 酸W外，還含有組氨酸標簽，其由SEQIDNO:3編碼，其中，第1-166位為IFNA的氨基酸序 列，由SEQIDNO:3中第1-498位核巧酸編碼；第167-177位連接膚的氨基酸序列，由SEQ IDNO:3中第499-531位核巧酸編碼；第178-184位為膠原結合結構域（CBD)的氨基酸序 列，由SEQIDNO:3中第532-552位核巧酸編碼；第185-186位為連接膚的氨基酸序列，由 沈QIDNO:3中第553-558位核巧酸編碼；第187-192位為組氨酸標簽，由沈QIDNO:3中 第559-576位核巧酸編碼。
[0015] 本發明還提供了一種制備前述干擾素A化與膠原結合結構域的融合蛋白的方法， 包含如下步驟：
[0016] i、取前述的重組大腸桿菌組菌，接種到LB培養基上，37°C、200r/min培養12h，得 菌液；
[0017]ii、取步驟i的菌液按2ml:100ml的接種量轉接至LB培養基中，37°C、200r/min 培養，至0D600值達到0. 8~1時，加入IPTG至終濃度為Immol/l，誘導表達地；
[001引扯、離心得菌體，裂解，取上清，分離純化，即得。
[0019] 步驟化中，所述分離純化采用His-tag磁珠純化試劑盒分離純化。
[0020] 本發明還提供了前述核巧酸序列重組載體、重組菌、干擾素A2b與膠原結合結構 域的融合蛋白在制備治療抗腫瘤藥物中的用途。
[0021] 優選地，所述制劑為緩釋制劑。
[0022] 進一步優選地，所述緩釋制劑的輔料為膠原，其中，融合蛋白與膠原的重量比為融 合蛋白與膠原的重量比為138:1000。
[0023] 進一步優選地，所述膠原為I型膠原。
[0024] 本發明還提供了一種抗腫瘤藥物，它是W前述核巧酸序列、重組載體、重組菌和/ 或干擾素A化與膠原結合結構域的融合蛋白為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而 成的制劑
[0025] 與天然的干擾素A化相比，本發明干擾素A2b與膠原結合結構域的融合蛋白 (IFNA-CBD)更容易特異結合在腫瘤組織上，不會很快隨體液擴散，相同劑量下，本發明干擾 素A2b與膠原結合結構域的融合蛋白可W更好的抑制腫瘤組織生長，存活時間顯著延長， 對腫瘤的治療效果明顯更佳，臨床應用前景良好。
[00%] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于W下的實施例。凡基于本發明上述內 容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0027] 圖1為IFNA-CBD和IFNA蛋白結構示意圖 陽02引圖2為MCF-7細胞生長曲線
[0029] 圖3為IFNA-CBD和IFNA在體外與膠原的結合能力
[0030] 圖4為CH-IFNA-CBD與CH-IFNA蛋白釋放曲線
[0031] 圖5為裸鼠荷瘤體積
[0032] 圖6為裸鼠生存期曲線
【具體實施方式】
[0033] 實驗材料和儀器：
[0034] DNA聚合酶（內.imeSTAR雖MaxDNAPolymerase, !"akara,日本） |；0〇35]DNA標準品（Takara，日本）
[0036] DNA連接試劑盒（Takara，日本）
[0037] 快速DNA產物純化試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，中國）
[0038] 高純度質粒小抽提試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，中國）
[0039] 細菌蛋白抽提試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）
[0040] 包涵體蛋白溶解液（康為世紀生物科技有限公司）
[0041 ] 瓊脂糖度lowest,西班牙）
[00創核酸染料Gelview(百泰克生物技術有限公司，中國） 柳創 酶切緩沖液Oi攝抽art黎Buffer(肥B，美國） W44] 甜aI限制性內切酶（肥B，美國） W45] 化OI限制性內切酶（肥B，美國）
[0046] 大腸桿菌感受態細胞株Tran巧a(全式金生物技術有限公司，中國） 陽047] 大腸桿菌感受態細胞株化ansetta(全式金生物技術有限公司，中國） |；0〇4引瓊脂（Amresco,美國）
[0049]IPTG(Amresco,美國）
[(K)加]咪挫（Amresco,美國）
[0051] 酵母提取物（0X0ID，英國） 陽化引膜蛋白腺（0X0ID，英國）
[0053] 氯化鋼（分析純，成都科龍化工試劑廠，中國）
[0054] 氯化鐘（分析純，成都科龍化工試劑廠，中國）
[0055] 化OH(分析純，成都科龍化工試劑廠，中國）
[0056] 乙醇（分析純，成都科龍化工試劑廠，中國）
[0057] 硫酸卡那霉素（碧云天生物技術，中國）
[0058] 考馬斯特亮藍染色液（碧云天生物技術，中國）
[0059] HRP標記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體（碧云天生物技術，中國）
[0060] 儀組氨酸標簽蛋白純化磁珠（海貍生物科技有限公司，中國）
[0061]蛋白質標準品（ThermoScientific,美國）
[0062] PBS(中杉金橋生物技術有限公司，中國）
[0063] 人乳腺癌細胞系MCF-7(中科院上海細胞庫，中國）
[0064] RPMI 1640培養基化yclone，美國） 陽0化]FBS度I，W色列）
[0066] 膜蛋白酶（Gibco,