黃花蒿二氫黃酮醇氧化酶基因AaDHFO2及其編碼蛋白與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程技術領域，具體設及一種黃花葛二氨黃酬醇氧化酶基因 AaDHF02及其編碼蛋白與應用。
【背景技術】
[0002] 黃酬類化合物（flavonoid)是W黃酬（2-苯基色原酬）為母核而衍生的一類黃色 色素，其中包括黃酬的同分異構體及其氨化的還原產物，也即WC6-C3-C6為基本碳架的一 系列化合物。黃酬類化合物在植物界分布很廣，在植物體內大部分與糖結合成巧類或碳糖 基的形式存在，也有W游離形式存在的。天然黃酬類化合物母核上常含有徑基、甲氧基、控 氧基、異戊締氧基等取代基。由于運些助色團的存在，使該類化合物多顯黃色。又由于分子 中丫-化酬環上的氧原子能與強酸成鹽而表現為弱堿性，因此曾稱為黃堿素類化合物。根 據=碳鍵（C3)結構的氧化程度和B環的連接位置等特點，黃酬類化合物可分為下列幾類： 黃酬和黃酬醇；二氨黃酬醇（又稱二氨黃酬）和二氨黃酬醇醇（又稱二氨黃酬醇）；異黃 酬；異二氨黃酬醇（又稱二氨異黃酬）；查耳酬；二氨查耳酬；澄酬（又稱澳巧）；黃燒和黃 燒醇；黃燒二醇（3,4)(又稱白花色巧元）。黃酬類化合物在植物體中通常與糖結合成巧類， 小部分W游離態（巧元）的形式存在。
[0003] 黃酬類化合物在自然界分布非常廣泛，一般C3上的徑基與母核上其他位置上的 徑基性質不完全相同，所W帶有C3-0H的衍生物稱為黃酬醇類，例如，黃琴素和黃琴巧（烙 點223°C)屬于黃酬類，懈皮素（烙點316-318°C)和蘆下（烙點188-190°C)屬于黃酬醇 類。
[0004] 黃酬類分子中，苯環與苯乙締基接于同一幾基上，組成了交叉共輛體系，因而能顯 灰黃到黃色顏色。顏色的深淺與取代基的性質和位置有關，一般認為在C7位或C巧位引入 徑基或甲氧基可使化合物顏色加深。黃酬類（配基）一般難溶于水或不溶于水，易溶于甲 醇、乙醇、乙酸乙醋等有機溶劑。分子內引入的徑基數目越多，則在水中的溶解度越大。徑 基經甲基化后，則增加在有機溶劑中的溶解度；徑基與糖結合成巧后，水溶性相應提高，而 在有機溶劑中的溶解度相應減小。黃酬類分子中多為酪性徑基，故顯酸性，可溶于堿性水溶 液、化晚等。 陽0化]由兩蕊蘇木忍材中分離出的逮斯替蒙黃酬是一種黃酬醇的內醋衍生物，烙點 315°C。由水寥葉中分離出的水寥素，是黃酬醇硫酸氨鐘的醋類，烙點28(TC。由二分子黃 酬衍生物聚合（見聚合反應）所成的二聚物稱雙黃酬類。有的通過C-C鍵聚合，也有的通 過酸氧鍵縮合（見縮合反應），聚合的位置也有區別，例如：銀杏葉中含有的銀杏素（烙點 344°C)O
[0006] 絕大多數植物體內都含有黃酬類化合物，它在植物的生長、發育、開花、結果W及 抗菌防病等方面起著重要的作用。黃酬類化合物中有藥用價值的化合物很多，如原珍向天 果、槐米中的蘆下和陳皮中的陳皮巧，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂 和膽固醇，用于防治老年高血壓和腦溢血。由銀杏葉制成的舒血寧片含有黃酬和雙黃酬類， 用于冠屯、病、屯、絞痛的治療。全合成的乙氧黃酬又名屯、脈舒通或立可定，有擴張冠狀血管、 增加冠脈流量的作用。許多黃酬類成分具有止咳、桂疲、平喘、抗菌的活性。護肝，解肝毒、 抗真菌、治療急、慢性肝炎，肝硬化。不少治療冠屯、病有效的中成藥均含黃酬類化合物，研 究發現蘆下、搬皮素、葛根素W及人工合成的立可定等均有明顯的擴冠作用；搬皮素、蘆下、 金絲桃巧、葛根素、燈盞花素、葛根總黃酬、銀杏葉總黃酬對缺血性腦損傷有保護作用；金絲 桃巧、水飛劑素、木犀草素、沙棘總黃酬對屯、肌缺血性損傷有保護作用；銀杏葉總黃酬、葛根 素、大豆巧元等對屯、肌缺氧性損傷有明顯保護作用。此外，沙棘總黃酬、苦參總黃酬、甘草黃 酬（主要為甘草素和異甘草素）具有抗屯、律失常作用。木犀草素、黃岑巧、黃岑素等均有一 定的抗菌作用；搬皮素、二氨搬皮素、桑色素、山奈酪等具有抗病毒作用；從菊花、猜牙菜中 分離得到的黃酬單體對HIV病毒有較強抑制作用，大豆巧元、染料木素、雞豆黃素A對HIV 病毒也有一定抑制作用。
[0007]黃花葛（ArtemisiaannuaL.)又名臭葛，為菊科（Asteraceae)葛屬（Artemisia) 植物，黃花葛葉、花和莖中含有豐富的黃酬類化合物。黃花葛中含有豐富的黃酬類化合物， 研究表明黃花葛葉黃花葛具有抑制多種腫瘤細胞的藥理功能，其機理可能與黃花葛葉中黃 酬類化合物的抗氧化作用、抑制相關酶的活性、降低腫瘤細胞耐藥性、誘導腫瘤細胞調亡及 雌激素樣作用等有關。此外，更重要的是，黃花葛中的黃酬類化合物與青葛素具有協同作 用，促進青葛素治療追疾W及抗癌的效果。由此可見黃花葛葉黃酬類化合物具有重要的開 發前景。然而，目前對黃花葛黃酬類化合物的生物合成及其調控機理不清楚，尚無相關的關 鍵酶基因克隆的報道。本發明W黃酬類化合物含量差異非常顯著的兩個黃花葛為材料，采 用消減雜交技術（SSH)，從中獲得差異表達基因，在此基礎之上通過半定量RT-PCR、生物信 息學、過表達、體外酶反應W及基因沉默的方法對候選基因進行功能驗證，最終獲得了一條 黃花葛二氨黃酬醇氧化酶基因。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種黃花葛二氨黃酬醇氧化酶基因AaDHF02,其核巧酸序 列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 本發明的另一目的在于提供上述黃花葛二氨黃酬醇氧化酶基因AaDHF02編碼的 蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本發明的二氨黃酬醇氧化酶基因AaDHF02是從黃花葛（ArtemisiaannuaL.)中 克隆得到的一種新的二氨黃酬醇氧化酶基因（現將該基因命名為AaDHF02)，其核巧酸序 列如SEQIDNo. 1所示，該基因全長為1978bp，分析表明，該序列包含一個完整的編碼區 lOOSbp，5'非翻譯區扣TR) 54化P，3'非翻譯區388bp和polyA尾己35bp，編碼335個氨基酸 組成的蛋白（二氨黃酬醇氧化酶）。由該基因編碼的二氨黃酬醇氧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。該蛋白的分子量為37. 86邸曰，等電點為5. 32,與黑屯、菊（Riulbeckiahbta) 中的二氨黃酬醇氧化酶（ABN79672. 1)序列有86 %的一致性（identity),在196-296位點 區域含有一個化20Gdio巧genase結構域，在287位殘基含有一個2-〇xoglutarate結合位 點，在22U223和277位殘基各含有一個化化結合位點。為便于表述，將該二氨黃酬醇氧 化酶命名為AaDHF02。
[0011] 應理解，考慮到密碼子的簡并性W及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員 可W根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。因而，本發明二氨黃酬醇氧化酶基因還包 括由SEQIDNo. 1所示核巧酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核巧酸，得到編碼 AaDHF02的核巧酸序列。
[0012] 此外，應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的二氨黃酬醇氧化酶的氨基 酸序列（SEQIDNo. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基 酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區段，將第120位的Q替換為V。因此，本發明 二氨黃酬醇氧化酶還包括SEQIDNo. 2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾 個氨基酸，具有與AaDHF02同等活性的由AaDHF02衍生得到的蛋白質。
[0013] 本發明的又一目的是提供含有二氨黃酬醇氧化酶基因AaDHF02的載體：重組表達 載體pET28a(+) -AaDHF02 和基因沉默載體pHellsgate8-AaDHF02。
[0014] 將本發明的AaDHF02基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明蛋白的 重組表達載體或抑制本發明基因表達的基因沉默載體，進一步將該重組表達載體或者基因 沉默載體導入適當的宿主細胞中，獲得表達本發明AaDHF02的基因工程菌，或者轉基因黃 花葛或組織。
[0015] 在本發明實施例中，根據AaDHF02編碼區序列設計包含酶切位點的引物，通過 RT-PCR的方法先克隆到T-easy載體上，測序正確后將AaDHF02克隆到原核表達載體祀T28 的多克隆位點，轉化大腸桿菌化21 0E3)，進行誘導表達，優化條件，獲得具有活性的二氨黃 酬醇氧化酶。實驗表明，AaDHF02能夠催化二氨黃酬醇形成黃酬醇。
[0016] 在本發明實施例中，根據AaDHF02全長序列設計引物，擴增AaDHF02全長序列中 的3(K)bp-600bp的基因片段，通過BP反應連接到PD0NR221構建中間載體，測序正確后將中 間載體與抑el1Sgate8通過LR反應獲得Aa畑F02基