一種蘋果酸脫氫酶基因rkmdh2及其重組表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001]以紅冬抱酵母kratochvilovae)YM25235 的總 RNA 反轉錄產物cDNA為模板，擴增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體后誘導表達，親和層析法純化后得到純酶，并對該酶進行了酶活測定及酶學性質的相關研究，屬于基因工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內，是一種活性非常強的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉化反應，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進胞質和亞細胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細胞內定位的不同其表達種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細胞胞質內，擔負著將NADH轉入線粒體的重任，并且還對調控三羧酸循環有作用，同時cMDH還是核酸通路(NACh)復合體的一個組成部分
蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強的酶，根據亞細胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細胞漿以及錐蟲甘油體內。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫學方面也引起越來越多的關注如利用基因工程疫苗預防人體帶絳蟲病已是備受關注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學分析，預測到胞漿型MDH是一個潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC (彌散性血管內凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領域，蘋果酸脫氫酶用于有機酸含量的測定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質的測定，應用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶。
[0003]總之，MDHs作為生物體中樞代謝途徑的關鍵酶，國內外對其己進行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個體發育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結構及功能、催化機制，對于酶重組蛋白的表達、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機制有著重要的意義。同時MDH的應用研究也將會推動MDHs轉基因植物及手性藥物的進一步發展。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種從紅冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分離的蘋果酸脫氫酶基因欣置扮么該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列，該基因序列長為1008bp(堿基)，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0005]本發明的另一目的是提供一種含有蘋果酸脫氫酶基因欣置%2的重組表達載體pET32aRKMDH2，該重組表達載體是將SEQ ID NO: 1所示基因直接與載體pET32a ( + )所構建的重組表達載體。
[0006]本發明另一目的是提供一種含有上述的蘋果酸脫氫酶基因欣或上述的重組表達載體的宿主表達細胞。
[0007]用本發明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體優化宿主細胞可用本領域的技術人員熟知的方法進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期收集菌體，用CaCl2、電穿孔等方法進行；當宿主是真核生物，可選用DNA轉染法、顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等方法。
[0008]本發明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉化至微生物細胞體內生產蘋果酸脫氫酶，具有產物特異性高、生產周期短、生產不受場地、氣候、季節的影響及利用不同的菌種和培養基適合開發商業化蘋果酸脫氫酶等優點。本發明應用基因工程技術構建特異性生產蘋果酸脫氫酶的轉基因大腸桿菌生產蘋果酸脫氫酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優點，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產奠定基礎。
【附圖說明】
[0009]圖1為利用本發明的紅冬孢酵母YM25235蘋果酸脫氫酶基因構建的大腸桿菌重組表達質粒pET32aRKMDH2質粒圖譜；
圖2為本發明的蘋果酸脫氫酶基因銹導表達并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:1為蛋白電泳Marker ;2為轉化了 pET32a(+)并經IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉化了 pET32aRKMDH2并經IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。
[0011]實施例1:紅冬孢酵母蘋果酸脫氫酶基因RKMD_H
米用 OMEGA 試劑盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 從紅冬抱酵母{Rhodosporidiimkra toch vilo vae) YM25235 中提取總 RNA，用反轉錄試劑盒 Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1 μ 1為模板進行聚合酶鏈式反應，設計引物(引物1和引物2)進行PCR擴增，反應所用引物、組分和擴增條件如下:
引物 P1:RKMDH2F1: 5，-ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCT-3’ (SEQ ID NO:3)
引物 P2:RKMDH2R1: 5，-TCAGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3’ (SEQ ID N0:4)
PCR擴增體系(50 μ L)組成如下:
5 X Trans PFU Buffer10 μ L
dNTP (2.5 ymol/L)5 yL
cDNA1 μL
RKMDH2F1 (10 ymol/L)2 yL
RKMDH2R1 (10 ymol/L)2 yL Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L)2 μ L
無菌ddH20補足至50 μ L
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s、59°C 45s、72°C 1.5 min進行30個循環，最后72°C lOmin，反應完后取產物1 μ L，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進行電泳分析。經凝膠成像系統成像確認片段大小正確后，用百泰克生物技術有限公司多動能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴增得到的目的基因連接到pMD18-T上，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板進行篩選，挑取平板上的轉化子進行菌落PCR篩選陽性克隆，然后送去上海生工測序。測序結果顯示，獲得一段1008bp長的序列，命名為欣么序列組成如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。通過核苷酸序列所編碼的氨基酸相似性搜索表明，該基因編碼的蛋白與真菌來源的蘋果酸脫氫酶序列相似，但不完全相同。
[0012]實施例2:重組表達質粒pET32aRKMDH2的構建
采用實施例1中的cDNA為模板進行PCR擴增，反應所用引物組合、反應組分和擴增條件如下:
引物 P1:RKMDH2F2: 5’ -CGCGGATCCATGGGCCTCAAGAC