棉花植物事件aC20-3以及用于其檢測的引物和方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物分子生物學領域，尤其是農業生物技術研究中的轉基因農作物育 種領域，特別是涉及具有改良棉花纖維品質的棉花轉化事件aC20-3,W及檢測該轉化事件 的特有方法。
【背景技術】
[0002] 棉花纖維是棉花生產的主要產品，棉花纖維的產量和品質直接決定了棉花生產的 產值和效益。因此，提高棉花纖維品質一直是棉花育種的主要目標。但是棉花的產量和品質 均為數量性狀，受到多種因素的影響并且產量與品質之間存在負相關，嚴重阻礙著棉花纖 維品質和產量的同步改良。棉花栽培品種主要是陸地棉，而優良纖維品質基因主要源于二 倍體的瑟伯氏棉（纖維強度）、異常棉（纖維強度與細度）W及四倍體的海島棉（纖維強度 與細度）等。送些優良性狀基因的利用，在常規育種中卻受到諸多限制，單靠現有的棉花遺 傳種質資源和常規育種手段已經難W大幅度提高棉花產量，難W滿足快速發展的紡織工藝 革命對纖維品質的要求。利用基因工程技術育種可W打破物種間的遺傳障礙，實現優良目 的基因的定向轉移，同時具有后代易于穩定，育種周期短等優點，送為棉花纖維產量和品質 的改良提供了新的途徑。但是目前人們還未得到與棉花纖維形成，W及產量和品質（強度、 細度和長度等）直接相關的基因，使得利用基因工程改良棉花纖維缺乏有效的目的基因。
[0003] 棉纖維的品質主要由棉花纖維細胞的分化與發育階段決定，是一個復雜有序的過 程，在不同的發育時期均有大量的基因表達，參與纖維細胞發育的調控。棉纖維細胞由胚珠 外珠被單個細胞分化而來，是高等植物中伸長最快、合成纖維素最多的模式單細胞。其分化 和發育過程可分為纖維細胞分化與突起、纖維細胞的迅速伸長、次生壁的合成和脫水成熟4 個時期，是多種基因共同表達調控的復雜過程。其中纖維伸長和次生壁合成兩個時期部分 重疊，對纖維的發育與品質形成關系密切。棉纖維的品質主要包括纖維長度、強度、伸長 率、馬克隆值等性狀。纖維的起始與伸長直接影響到纖維的數量與長度，而次生壁加厚期纖 維素的合成則影響纖維的強度與麥克隆值等性狀。人們對棉花纖維發生、發育和品質形成 的分子機理也知之甚少。送些都極大的阻礙了對棉花纖維進行產量和品質改良的進程。
[0004]目前通過分子生物學手段改良棉花纖維品質的思路主要是通過植物轉基因技術 導入能調控棉花體內激素、纖維素及多糖合成的基因。化hn等（1996)將己醜CoA還原酶基 因（地aB)和P皿合酶基因（PhaC)導入到陸地棉栽培種中，轉基因棉纖維品質如強度、長度 等雖然沒明顯的改良，但轉基因棉花的吸熱性和導熱性能明顯增加。化hn(1999)將與生長 素合成相關的基因iaaM和ia址導入常規棉花中，雖然轉基因棉纖維中IAA的含量顯著地 增加，然而纖維長度、細度和強度與對照相比沒有顯著差異。Jiang等（2011)將纖維素合酶 基因（化SusAl)轉入棉花中，結果表明過度表達化SusAl基因的棉花株系纖維品質明顯高 于非轉基因株系。
【發明內容】
[0005] 本發明人通過轉基因方法獲得了轉基因事件aC20-3的棉花品系。該轉化事件 具有穩定的改良棉花纖維品質的性狀。其代表性種子已保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中必，保藏編號為；CGMCCNo. 8880,分類命名為陸地棉，拉了文名稱是 Gossypiumhirsutum，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生 物研究所，保藏日期為2014年5月8日。
[0006] 本發明第一方面提供棉花轉化事件aC20-3,其特征序列如SEQIDNo;21所示， 其由第1118-6544bp的T-DNA插入序列、第l-1117bp的上游側翼棉花基因組序列和第 6545-738化P的下游側翼棉花基因組序列構成。
[0007]本發明第二方面提供一種核酸構建體，其包含所述棉花轉化事件aC20-3。
[000引本發明第H方面提供一種重組載體，其包含本發明第一方面所述的T-DNA插入序 列或含有棉花轉化事件aC20-3的核酸構建體。在一個實施方案中，所述載體為說明書附圖 1 中的p2300-pE200-mCBD載體。
[0009] 本發明第四方面提供一種重組細胞，含有本發明第一方面所述的T-DNA插入序列 或本發明第二方面所述的核酸構建體或本發明第H方面所述的載體，所述重組細胞為重 組農桿菌細胞。
[0010] 本發明第五方面提供用于檢測本發明第一方面所述的棉花轉化事件的引物對，其 由特異性識別本發明第一方面所述的T-DNA插入序列的第一引物和特異性識別本發明第 一方面所述的任一側翼序列的第二引物組成。在一些實施方案中，所述第一引物選自SEQ IDNO或23時，所述第二引物選自SEQIDNO;14或16。在另一些實施方案中，所述第 一引物選自沈QIDNO;18或24時，所述第二引物選自沈QIDNO;25或19。
[0011] 本發明第六方面提供一種鑒定棉花生物樣品中aC20-3轉基因事件的方法，其包 括：
[001引 （a)從待鑒定的棉花生物樣品提取DNA樣品；
[001引 化）W提取的DNA樣品為模板，使用權利要求6或7所述的引物對進行PCR擴增；
[0014] (C)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物長度與SEQIDNO;21上所述PCR引物對的 序列之間的長度一致，則表明棉花生物樣品中aC20-3轉基因事件的存在。
[0015] 本發明第走方面提供了一種制備轉基因棉花的方法，培養含有本發明第一方面所 述的轉化事件的棉花種子或其他組織，包括：利用含有本發明第一方面所述的轉化事件材 料的棉花材料，與其它棉花育種材料進行雜交后，進一步進行回交，獲得含有本發明第一方 面所述的轉化事件的新材料；在雜交及回交過程中，利用本發明第六方面的方法在后代群 體中進行篩選鑒定，確認本發明第一方面所述的轉化事件的存在。
[0016] 本發明第八方面提供本發明第一方面所述的轉化事件、發明第二方面所述的核酸 構建體、發明第H方面所述的重組載體、發明第四方面所述的重組細胞、發明第六方面或發 明第走方面所述的方法用于提高棉花纖維品質、進行植物育種W及用作分子標記的用途。
[0017] 本發明中利用的編碼CBD蛋白的Cbd基因（GenBank;AAA23218. 1)來源于食纖維 梭菌（ClostridiumcelIulovorans)，該CBD蛋白是1990年由0.化oseyov從食纖維梭菌 中純化到的纖維素酶復合物的組成成分，該復合物對微晶纖維（crystallinecelluose)有 纖維酶的活性。實驗表明若將CB化從纖維素酶或纖維小體的腳手架結構中去除將極大的 降低酶活。E.Shpigel對CBDs的功能研究發現，CBDs能在體外增強PrunuspersicaL花 粉管的伸長；增加A.Xylinum纖維素合成酶的活性，促進纖維素的合成。其中SP序列來自 擬南芥CELl基因的N端24個堿基，為導膚序列。本發明利用纖維特異性啟動子EV0200驅 動SP+mCBD基因，利用農桿菌介導的方法轉化棉花，通過篩選獲得棉纖維衣份、比強和馬克 隆值均有明顯改善的單拷貝轉化事件aC20-3,并利用分子生物學手段獲得了該插入事件左 右兩側的棉花基因組序列。
[0018] 本發明創造出的mC抓基因的優質棉花轉化事件不僅可W顯著改善棉花纖維品 質，遺傳穩定、單拷貝整合且整合側翼序列分子特征清楚，在生產育種中具有重要應用價 值，而且由于具有獨特的檢測方法，可方便地通過雜交聚合的方式聚合不同的商業化轉化 事件。
【附圖說明】
[0019] 圖1示出了植物表達載體p2300-pE200-mCBD的構建流程。
[0020] 圖2示出了利用Southern雜交技術對轉基因事件aC20-3拷貝數進行檢測的實驗 結果。1，經化ndIII酶切的含mCBD基因的質粒；2,經EcoRI酶切的轉化事件aC20-3基 因組DNA件；3,經HindIII酶切的轉化事件aC20-3基因組DNA;Marker，經EcoRI/Hind III酶切的ADNA;
[0021] 圖3是右邊界（RB)旁側序列示意圖。
[00過圖4是左邊界（LB)旁側序列示意圖。
[0023] 圖5是aC20-3事件的插入序列及鑒定引物的示意圖。
[0024]圖 6 示出 了利用引物對RBcheckSl' /GSP2-mCBD32 '、RBcheck52 ' / GSP2-mCBD32'W及LBcheck31' /GSP2-NPTII52'、LBcheck32' /GSP2-NPTII52'分別 擴增aC20-3事件和冀棉14的棉花樣品結果。M，marker,ADNA/EcoRI+HindIII;1， 3 ;RBcheck51' /GSP2-mCBD32 '擴增aC20-3 事件和冀棉 14,陽性擴增條帶 1767bp;2， 4 ;RBcheck52' /GSP2-mCBD32'擴增aC20-3 事件和冀棉 14,陽性擴增條帶 1535bp;5,6 : LBcheck31' /GSP2-NPTII52 '擴增aC20-3 事件和冀棉 14,陽性擴增條帶 3197bp;8,7 : LBcheck32' /GSP2-NPTII52'擴增aC20-3 事件和冀棉 14,陽性擴增條帶 3152bp。
【具體實施方式】
[002引在本發明中，"轉化事件"是指外源插入DNA序列和特定棉花基因組DNA序列 的接合。"轉化事件"并不是一種植物細胞或植株，植物細胞或植株是轉化事件存在的載 體；轉化事件的核必特征是外源基因在植物基因組中特定位點的插入所形成的外源插入序 列和特定棉花基因組序列連接的一段特征DNA序