一種基于基因測序法的hla-b27基因分型的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體設及一種基于基因測序法的HLA-B27基因分型的 方法。
【背景技術】
[0002] 近年來研究HLA與疾病相關性的資料表明，某些疾病的發生率與一些特殊型別的 HLA檢出率有關，運些病人大多是發病機理不明并伴有免疫功能異常和有遺傳傾向性的疾 病，因此，分析HLA抗原表達情況不僅有助于了解發病機理，對于疾病的診斷、預防和預后 判斷都有重要意義。
[0003] HLA-B27基因屬于I型M肥基因，基本上表達在機體中所有有核的細胞上，尤其是 淋己細胞的表面有豐富的含量。早在二十多年前，人們就已發現HLA-B27抗原的表達與強 直性脊柱炎有高度相關性，超過90%的強直性脊柱炎患者其HLA-B27抗原表達為陽性，普 通人群中僅5-10%的為陽性，而強直性脊柱炎由于癥狀與許多疾病相似而難W確診，因此 HLA-B27的檢測在疾病的診斷中有著重要意義。
[0004] 強直性脊柱炎（A巧是一種W紙骼關節和中軸關節慢性炎癥為主的、原因不明的 自身免疫性疾病，W侵犯脊柱為主，早期表現為滑膜炎和初帶附著點的病變，晚期由于初 帶巧化造成脊柱強直，目前本病的發病原因和致病機制尚未完全明確。患者早期癥狀與腰 椎間盤突出癥、紙骼關節炎、腰背肌筋膜炎等相似，在X線片上沒有紙骼關節炎的明確表 現，因此在臨床診斷上容易混淆而致誤診，延誤病情早期治療，失去最佳治療時機，導致中、 晚期不可逆癥狀出現，最終發生關節強直甚至致殘。賴建銘等通過對AS家系調查發現， HLA-B27陽性的幼年AS患者中69%有脊柱關節病家族史，其中90%為一級親屬，顯示AS 有明顯的家族聚集性，說明AS的危害性很大。因此，早期診斷對控制患者病情發展、減輕崎 形、維持和改善功能，具有相當重要的意義。應盡可能地在肯定的放射學紙骼關節炎出現之 前進行診斷。在脊柱性關節病運一類的疾病中除了強直性脊柱炎W外，還有許多其它的疾 病與HLA-B27抗原的表達有著或多或少的相關性，因此HLA-B27的檢測在運些疾病的診斷 中是一個非常有價值的指標。
[0005] 文獻報道指出，①HLA-B27陰性和陽性患者男性發病率明顯高于女性，陰性與同 性別陽性患者平均發病年齡明顯偏晚；②HLA-B27陰性患者W31~45歲為主，陽性患者W 16~30歲為主；③HLA-B27陰性和陽性患者首發癥狀均W中軸關節炎和外周關節炎為主。 陰性和陽性患者主要臨床表現上均W出現下腰疼痛，髓部疼痛為主。陰性患者出現全身癥 狀（包括發熱、盜汗和乏力）明顯少于陽性患者。總之，HLA-B27陰性患者比同性別陽性患 者平均發病年齡明顯偏晚，部分陰性患者病情相對較輕。HLA-B27陰性和陽性患者發病上的 差異在對HLA-B27檢測陰性的疑似患者診斷中應得到重視。
[000引 目前可用于檢測HLA-B27的方法有流式細胞法、ELISA法、PCR-SSP法、測序法、巧 光PCR法等，但運些方法都存在不同程度的缺點。流式細胞法要求標本新鮮，不能長期保 存，因此不利于進行實驗室間質量評價；且該方法原理基于抗原抗體結合反應，而HLA-B27 的單克隆抗體會與其它HLA-B等位基因產物發生不同程度的交叉反應，出現假陽性結果。ELISA法成本低，結果數據客觀，但操作復雜，影響反應因素較多，結果準確性差，且固相載 體的包被難達到各個體之間的一致，因此每次測定均需作標準曲線。PCR-SSP法需要凝膠電 泳，多用于科研無法在醫院推廣。測序法最為準確，通常檢測分析周期稍長，分析樣本較多 時，若無前期篩選（陽性結果的初步篩選），其工作量較大，且往往需要重復確認（當擴增不 出結果時需要仔細分析確認擴增條件和擴增結果）；巧光PCR方法，采用巧光染料對擴增的 特異片段產生信號，通常擴增片段較小，無法進一步對HLA-B27進行分型。
[0007] 雖然上述方法在臨床HLA-B27檢測上扮演著重要角色，但卻各有其缺陷，一種操 作簡便、快速、且準確度高的檢測方法的開發將起到關鍵性臨床作用。目前尚無文獻報道利 用巧光PCR結合基因測序技術檢測HLA-B27不同基因亞型的方法。
【發明內容】
[0008] 為解決現有技術針對HLA-B27基因進行檢測分型中存在的技術問題，本發明提供 一種能夠快速、靈敏、特異的對HLA-B27基因進行分型的方法。
[0009] HLA-B27 基因型種類繁多，包括：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、 B27-06、B27-07、B27-08、B27-09、B27-10、B27-11、B27-12、B27-13、B27-14、B27-15、B27-16、 B27-17、B27-18、B27-19、B27-20、B27-21、B27-24、B27-27、B27-30、B27-32、B27-33、B27-34、 B27-35、B27-36、B27-41、B27-42等。HLA-B27各亞型的分布在不同地區、種群中存在差異， 發明人通過研讀文獻，尤其近幾年文獻中所提到的中國人群中出現的HLA-B27基因的特定 亞型，選定中國人人群中目前常見的HLA-B27基因型：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、 B27-05、B27-07、B27-10、B27-15 (尤其是B27-04、B27-05基因型在中國人群中出現的比例 最高），進行分析。本發明通過比對上述分型，找到其保守區域，設計了針對上述HLA-B27基 因亞型的測序引物及探針，通過巧光PCR結合測序的方法實現了HLA-B27基因的分型。
[0010] 通過本方法可W區分8種基因亞型及35種次亞型。各種分型的特異序列如下：
[0011] 表1 8種基因亞型及35種次亞型的特異序列
[0012]
[0014] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0015] 首先，本發明提供了一組用于HLA-B27基因型分型的引物及探針； [001引具體的，HLA-B27巧光PCR及測序用引物的序列如下：
[0017]HLA-B27F :5，-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3,（沈QIDN0:1)
[0018] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)
[0019] 巧光PCR換針的序列為：
[0020] HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3' (SEQ ID NO :3)
[002。所述HLA-B27探針的巧光發光基團為FAM，巧光澤滅基團為B冊-1。
[0022] 需要說明的是，本發明所述引物既要用于巧光PCR反應又要用于陽性結果的測 序的亞型及次亞型分型。本發明中引物的設計除了通常引物設計所要考慮的退火溫度、 GC含量、引物特異性等方面，更要考慮兩個重要因素：（1)本發明由于采用巧光PCR法，而 巧光PCR擴增產物通常不太長，否則影響擴增效率，化qman探針為基礎的Real-timePCR W引物和探針序列決定反應的特異性，而通過巧光強度判斷探針降解程度，從而推斷模板 量，通常擴增產物越短，探針和上下游引物之間的距離越近，擴增過程中探針5端的發光基 團可W高效的切除下去，保證擴增和巧光信號的增長同步進行，巧光PCR擴增片段通常在 75-200bp;(2)本發明需要利用測序法具體分型，因此擴增產物要包含所有亞型及次亞型 的特異區域，且盡量一個測序反應即可完成，擴增片段較短無法有效包含亞型及次亞型的 特異序列區域，也不利于測序分析。
[0023] 本發明通過比對HLA-B27各分型序列，設計多對引物，經實驗反復驗證后確定 本發明所列出的測序引物為最佳引物，能夠兼顧巧光PCR和常規測序擴增PCR的需要， 其他引物對較難實現巧光PCR反應的準確率和測序（發明人曾設計巧光PCR引物對 照組進行過試驗，包括對照組 1:HLA-B27-F1 :GGCTACGTGGACGACACGCTGT，HLA-B27-R1 : GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC;對照組 2 :HLA-B27-F2 :GGGTCTCACACCCTCCAGAAT， HLA-B27-R2 :CGGCGGTCCAGGAGCT，雖可W有效進行巧光PCR反應，但均無法覆蓋上述中國人 群中出現的HLA-B27基因的特定亞型及次亞型測序分析）。
[0024] 本發明引物在保證PCR擴增準確率的前提下，擴增產物既要使巧光PCR有效，又要 使其包含所有分型的特異區域便于測序分型，擴增片段長度達6(K)bpW上，仍能有效的保 證巧光PCR的特異性和擴增效率。
[00巧]進一步的，為了檢測擴增模板的有效性，本發明還設計了一對內參引物及探針，內 參為e-Actin。具體的，P-Actin內參引物的序列如下：
[0026]e-ActinF:5，-CACCCAGCACAATGAAGA-3,（沈QIDN0:4)
[0027] 0-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'（SEQIDN0:5)
[002引內參探針的序列為：
[0029]e-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'(沈QIDN0:6)
[0030] 所述內參探針的巧光發光基團為FAM，巧光澤滅基團為B冊-1。
[0031] 其次，本發明提供了一種用于HLA-B27基因分型的試劑盒，包括內參體系反應液 A、檢測體系反應液B、酶解試劑、測序引物、測序試劑、陰性對照和陽性對照，
[003引內參體系反應液A包括：PCR緩沖液、Mg2\ dNTPs、擴增內參基因的引物及探針，巧 光PCR反應酶系；
[0033] 檢測體系反應液B包括：PCR緩沖液、Mg2\dNTPs、引物及探針，巧光PCR反應酶系， 檢測體系反應液B中的引物序列如下：
[0034]HLA-B27F:5，-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3,（沈QIDN0:1)
[0035] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)
[003引探針的序列為：
[0037]HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3' (SEQ IDNO:3)
[003引所述HLA-B27探針的巧光發光基團為FAM，巧光澤滅基團為B冊-1;
[0039]測序引物為HLA-B27F :5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'（沈QIDN0:1)
[0040] HLA-B27R:5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(沈Q ID N0:2)。
[0041] 優選的，內參體系反應液A包括：10XPCR緩沖液、MgCl22.0~5.0mM、dNTPs0.5~ I. 5mM、引物 0. 2 ~2.OyM、探針 0.I~I. 0yM、Taq酶 2. 0 ~4. 0U、UNG酶 0. 5 ~I.OU，所 述引物為P-ActinF:5' -CACCCAGCACAATGAAGA-3'，0 -ActinR:5' -AAGGTGGACAGCGAGGC-3'， 探針的序列為：e-ActinP:5' -CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探針的巧光發光基團為 FAM，巧光澤滅基團為B冊-1。
[004引其中所述酶解試劑優選為10XCIAP緩沖液、CIAP酶、ExoI酶和水，體積比為 10:1:2:12。
[0043] 其中所述測序試劑為測序Buffer和Bi曲ye，體積比為1:1。
[0044] 優選，陰性對照為水；陽性對照為含有HLA-B27基因的人類基因組DNA溶液。
[0045] 此外，本發明還提供了基于上述檢測引物和/試劑盒的進行HLA-B27等位基因檢 測