水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛源性成分鑒定中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及動物分子生物學領域，具體設及水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛 源性成分鑒定中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著人民生活水平的提高，肉品消費量的增加，市場上也出現了各種肉制品滲假 的現象。在肉品的進出口貿易中，由于我國對肉品質質量的檢驗方法較為落后，錯檢、漏檢 現象時有發生。W次充好，滲雜滲假嚴重影響了公平交易、食品安全，甚至設及到宗教信仰 問題。因此肉制品來源的安全性成為消費者關屯、的焦點問題之一，而對肉制品的來源進行 鑒定并建立便捷的檢測方法是解決運一問題的關鍵。
[0003] 現有技術中對于肉源食品的鑒定主要包括蛋白質分析法，例如電泳法、免疫法等 技術，運對于生肉的鑒別具有一定可行性，但特異性差、準確率低。國內已發表的針對水牛 屬特異性的檢測方法，是通過大量的測序工作和比對分析，獲得屬間物種特異性基因位點， 由此設計特異性引物并用于物種鑒別。然而針對該目標序列設計的特異性引物僅可用于水 牛、黃牛與巧牛的鑒別，而對其他物種是否也適用并未做研究。因此，如何有效、準確地判別 出肉制品是否屬于水牛肉，并建立一種簡單易行的檢測方法具有緊迫性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于針對現有技術不足，提供一種可用于水牛源性制品特異性檢測 的引物；
[0005] 本發明的第二個目的在于提供用于水牛源性制品檢測的檢測試劑盒；
[0006] 本發明的目的還在于提供水牛源性成分的鑒定方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明從種內一致性和穩定性、種間特異性、拷貝數等方面進行 水牛基因組特異DNA序列的篩選，經過普通牛、羊（綿羊、山羊）、豬、馬、驢、鼠（大鼠、小鼠、 倉鼠）、豚鼠、雞、鴨、碟、兔、狗、狐、水貂和駱子的基因組DNA及不同的水牛品種DNA中的檢 ，篩選在水牛中特異的、在其他物種中不存在或同源性低的DNA片段作為檢測分子。經過 大量分析和實驗工作，最終獲得可供檢測使用的特異DNA序列，其核巧酸序列如序列表SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 基于此，本發明首先提供一種水牛特異性引物，其能特異性擴增SEQIDNo. 1所示 的核巧酸序列或該序列的特異性片段。
[0009] 優選地，引物長度為18~27bp。引物的設計需要考慮是否容易發生錯配、擴增片 段長度、反應溫度等多方面。
[0010] 優選地，該引物序列如下：
[0011] SUBALUS-F: 5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3,
[0012] BUBALUS-R:5' -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3';
[0013] 或該引物向5'、3'端延伸或修飾得到的仍能特異性擴增SEQIDNo.I所示序列 的引物。
[0014] 進一步，本發明提供含有上述特異性引物的檢測試劑盒。
[001引優選地，所述試劑盒還包括下述試劑中的一種或多種：Taq酶、dNTPs、MgClz、PCR緩沖液、陽性對照DNA模板、雙蒸水；或者還包括下述試劑中的一種或多種：TaqDNA MasterMix、陽性對照DNA模板、雙蒸水。
[0016] 所述陽性對照DNA模板為牛科水牛屬的水牛基因組DNA模板；
[0017] 進一步，本發明提供上述的水牛特異性引物或檢測試劑盒在水牛源性成分鑒定中 的應用。
[0018] 本發明還提供水牛特異性引物、試劑盒及其在水牛源性成分鑒定中的PCR檢測方 法，其步驟如下所述：
[0019] 1)提取樣品基因組DNA;
[0020] 2)用上述的引物進行PCR擴增，并W水牛DNA模板為陽性對照，W雙蒸水為空白對 照；
[0021] 3)對PCR擴增產物進行檢測和結果判定。
[002引優選地，其中步驟2)PCR擴增的反應體系如表1 [0023]表1本發明PCR擴增的反應體系
[002引PCR反應程序如下：
[0026] 94°C預變性 5min;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 133,30次循環；4°(：降溫 2min〇
[0027] 結果判定方法是：當PCR反應產物與陽性對照擴增產物相符，且空白對照無擴增 產物時，判定樣品中檢測出水牛源性成分；當PCR反應產物無擴增產物或與陽性對照擴增 產物不符，且空白對照無擴增產物時，判定樣品中未檢測出水牛源性成分；如果陽性樣品未 檢測出預期片段，說明試劑失效或操作失誤；若空白對照與陽性樣品均檢出，說明試劑污染 或操作失誤。
[0028] 本發明中檢測結果可用瓊脂糖凝膠電泳呈現，也可用測序或其他有效方法檢測； 提取樣品DNA的方法可用苯酪-氯仿提取法，也可使用公認的、具有相同效力的其他提取方 法。
[0029] 本發明提供了有效的、精準的、可靠的水牛源性成分分子鑒定方法，所組裝的試劑 盒能快速鑒定樣品中是否含有水牛源性成分。本發明的方法可W在肉品、飼料和皮張檢測 中作為標準檢測方法使用。本發明試劑盒及檢測方法具有簡便、快速、全面、特異性強的特 點，且成本較低，適用性廣。
【附圖說明】
[0030] 圖1是SEQIDNO. 1核巧酸特異序列在水牛中具有物種特異性的檢測結果。W牛 科水牛屬的水牛、牛科非水牛屬動物（普通牛、綿羊、山羊）和非牛科哺乳動物（小鼠、大 鼠、倉鼠、豚鼠、豬、馬、驢、兔、狐、狗、水貂、駱子）W及非哺乳動物（雞、鴨、碟）的基因組 DNA為模板，擴增SEQIDNo. 1所示的特異片段，所有測試樣品中僅在水牛中得到擴增產物， 非水牛物種中均無擴增產物。結果表明所擴增片段在水牛中具有特異性。泳道中編號說明 如下：M:為DL2000P1USDNAMarker;1-3 :空白對照；4-6 :水牛；7-9 :小鼠；10-12 :大鼠； 13-15 :倉鼠；16-18 :豚鼠；19-21 :普通牛；22-24 :綿羊；25-27 :山羊；28-30 :豬；31-33 : 馬；34-36 :驢；37-39 :雞；40-42 :鴨；43-45 :碟；46-48 :兔；49-51 :狐；52-54 :狗；55-57 : 水貂；58-60 :駱子。
[0031] 圖2:是SEQIDNO. 1核巧酸特異序列在水牛不同DNA模板濃度中的靈敏度檢測結 果。分別Wo.Ing/yLlng/yUlOng/yLIOOng/yL的水牛DNA為模板，擴增沈QIDNO. 1 核巧酸特異片段，Ing/yL的模板濃度即有擴增，表明特異性引物所擴增片段具有較好的靈 敏性。泳道中編號說明如下：M:為DL2000P1USDNAMarker;l-4:空白對照；5-8:0.Ing/ yL的模板濃度；9-12 :Ing/yL的模板濃度；13-16 :IOng/yL的模板濃度；17-20 :IOOng/ yL的模板濃度。
【具體實施方式】
[0032]W下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制，在不背離本 發明精神和實質的前提下，對本發明所做的修改或潤色均屬于本發明的范圍。
[0033] 實施例1樣品中水牛源性成分特異性檢測
[0034] 1.試樣的制備與保存
[0035] 1. 1 取樣
[0036] 采集水牛肉樣品Ig,于-20°C下保存備用。
[0037] 1.2DNA模板制備
[0038]DNA模板制備采用常用的苯酪-氯仿粗提法（薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂 斯T.分子克隆實驗指南[M].第2版.金冬雁，黎孟楓.北京：科學出版社，1999. 465-467) 或者公認的、具有相同效力的其他提取方法，運些方法都是報道的常用方法。
[0039] 2.引物設計
[0040] 本實施例的引物序列如表2和序列表SEQIDNO:2和3所示。
[00川表2本發明設計的PCR擴增引物
[0043]
[0044] 預期擴增片段大小為23化p，其核巧酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
[0045] 實驗表明，該引物特異性強，在水牛各品種中均能有效擴增，而在其他18個非水 牛物種中都無目的片段擴增；且引物的靈敏度較高，在模板DNA濃度為Ing/uL時即可擴增。 W上述引物分別向3'、5'延伸一個堿基和兩個堿基或修飾形成的引物對進行實驗，實驗 表明仍能進行特異性擴增，