砂梨品種清香果皮全褐性狀基因位點的分子標記及其篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子遺傳學領域，設及一種砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的 分子標記，尤其設及該種砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 砂梨是我國重要的南方果樹，屬于多年生木本植物，童期較長。果皮色澤是最重要 的果皮性狀之一，果皮顏色一致、無果誘是優質商品梨的重要指標。果皮褐色屬于果實性 狀，傳統雜交育種選育方法周期長、難度大。一般需要3~5年結果后才能開展初步鑒定。 通過定位果皮褐色性狀基因位點來輔助育種可W有效解決運一問題。
[0003] 遺傳研究表明，梨果皮全褐性狀受單個或數個主效基因位點控制，不同的材料其 控制果皮全褐性狀的基因位點可能會存在差異。
[0004]'清香'是由嘴世紀'（畢）與S花梨'U)雜交選育而成，果皮褐色性狀來自 花梨花梨'屬我國優良的地方品種，栽培歷史悠久，品質優良，是我國砂梨育種的 重要親本之一。'清香'（畢）與'翠冠'（S)進行雜交得到雜種Fl中，果皮全褐與非全褐 單株比經卡方檢測滿足1:1的分離比，運表明'清香'的果皮全褐性狀是單基因控制。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有的不足，公開了一種砂梨品種清香果皮全褐性狀基因位點的分子 標記，還公開該種砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記的篩選方法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得W解決。
[0007] 砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，基因位點位于砂梨品種'清 香'8號染色體，與其緊密連鎖的分子標記為Zaasp867引物，其序列為：
[0008]左端引物序列CCACCTCACCTTATCCCTCA，
[0009]右端引物序列GCGTTTGCTCCTCGTACTTC。
[0010] 擴增砂梨全褐果皮品種或育種材料DNA，獲得的擴增片段為14化P，即為砂梨品種 '清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，該基因位點位于砂梨品種'清香'8號染色體， 利用PCR對'清香'與'翠冠'雜交得到的Fl代進行檢測，果皮全褐單株準確率96.3%，利 用Excel軟件測得與果皮全褐性狀不相關的概率P值為0. 004。
[0011] 砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，基因位點位于砂梨品種清香 8號染色體，與其緊密連鎖的分子標記為Zaasp868引物，其序列為：
[0012]左端引物序列AAAAAGTGATGTGTGGATCGC， 陽〇1引 右端引物序列CTGGTGACTTGCAAGCTAGG。
[0014]擴增砂梨全褐果皮品種或育種材料DNA，獲得的擴增片段為129bp，即為砂梨品種 '清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，該基因位點位于砂梨品種'清香'8號染色體， 利用PCR對'清香'與'翠冠'雜交得到的Fl代進行檢測，果皮全褐單株準確率97.0%，利 用Excel軟件測得與果皮全褐性狀不相關的概率P值為0. 003。
[0015] 砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，基因位點位于砂梨品種'清 香'8號染色體，與其緊密連鎖的分子標記為Zaasp873引物，其序列為：
[0016]左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，
[0017]右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。
[0018] 擴增砂梨全褐果皮品種或育種材料DNA，獲得的擴增片段為24化P，即為砂梨品種 '清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，該基因位點位于砂梨品種'清香'8號染色體， 利用PCR對'清香'與'翠冠'雜交得到的Fl代進行檢測，果皮全褐單株準確率97.0%，利 用Excel軟件測得與果皮全褐性狀不相關的概率P值為0. 003。
[0019] 砂梨品種'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，基因位點位于砂梨品種'清 香'8號染色體，與其緊密連鎖的分子標記為Zaasp876引物，其序列為：
[0020] 左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，
[0021] 右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。
[0022] 擴增砂梨全褐果皮品種或育種材料DNA，獲得的擴增片段為24化P，即為砂梨品種 '清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，該基因位點位于砂梨品種'清香'8號染色體， 利用PCR對'清香'與'翠冠'雜交得到的Fl代進行檢測，果皮全褐單株準確率97.0%，利 用Excel軟件測得與果皮全褐性狀不相關的概率P值為0. 003。
[0023] 作為優選，基因位點為Rus. zaas-8。
[0024] W上提到的砂梨'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記的篩選方法，包括W下 方法：
[00對 A.W砂梨品種澤冠'為父本與砂梨品種'清香'進行雜交，得到雜種Fl; 陽0%] B.用CTAB法提取Fl群體各單株的DNA，采用簡單序列重復的標記SSR對兩親本 進行多態性引物篩選，通過聚合酶鏈式反應進行擴增，擴增產物在密度為0.〇8g/ml的聚丙 締酷胺凝膠上進行電泳分離分析，根據分子標記篩選結果，篩選出親本間有多態的引物， 親本間有多態的引物在Fl群體中進行分析，聚合酶鏈式反應擴增程序同上，獲取群體基因 型資料；
[0027] C.根據連鎖交換規律，利用群體基因型資料構建砂梨的遺傳連鎖圖，；
[0028]化果實成熟期對Fl每個單株進行果實皮色鑒定，獲得Fl每個單株的果實皮色性 狀；
[0029]E.根據每個分子標記的群體基因型資料和與其對應每個單株的果實皮色性狀，通 過分析與果皮全褐性狀相關的概率P值確定分子標記，P<〇. 05的分子標記，即為分子標記。
[0030] 作為優選，步驟B中，聚合酶鏈式反應在擴增儀上進行。
[0031] 作為優選，步驟C中，用軟件Mapmaker2. 0,最小LOD值設為3,獲得連鎖圖。
[0032] 作為優選，步驟E中，根據每個分子標記的群體基因型資料和與其對應每個單株 的果實皮色性狀，分析測得與果皮全褐性狀相關的概率P值，P<〇. 05的分子標記，即為分 子標記。果皮全褐性狀基因位點的位置由分子標記的染色體位置確定：在'清香'中發現 Zaasp867(P= 0. 004)、Zaasp868(P= 0. 003)、Zaasp873(P= 0. 003)、Zaasp876(P= 0. 003) 標記與砂梨果皮全褐性狀基因位點緊密連鎖，Zaasp867標記、Zaasp868標記、Zaasp873標 記和Zaasp876標記即為獲得的砂梨'清香'果皮全褐性狀基因位點Rus.zaas-8的分子標 記。
[0033] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0034] (1)本發明提供砂梨'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記，通過檢測與果皮 全褐性狀基因位點連鎖的分子標記，可W預測砂梨果實皮色性狀，加快砂梨果實皮色性狀 的選擇進度。
[0035] (2)通過本發明分子標記在國際上首次定位獲得了砂梨品種'清香'中的果皮全 褐性狀基因位點，它們可獲得96. 3%~97.0%的果皮褐色檢出率。砂梨為自交不親和樹 種，樹體為Fl雜種，基因組高度雜合，對砂梨果皮全褐性狀基因位點的精確定位工作居于 同領域前列。
[0036] (3)通過本發明分子標記定位的基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測運些與果 皮全褐性狀基因位點連鎖的分子標記，即可W預測砂梨植株的果皮褐色性狀，用于砂梨品 種或品系的基因型檢測，W判斷該品種或品系是否具有果皮全褐性狀，進而快速篩選目標 果實皮色品種或品系用于砂梨育種。質量性狀基因位點的檢測方便快速，不受環境影響。
[0037] (4)輔助育種選擇目標明確，節約成本。在傳統育種方法中，首先要等到植株度過 童期，結果后才可進行果實褐皮性狀調查，不僅周期很長，也占用了±地資源。因此傳統育 種不僅費時，而且成本高。通過檢測果皮全褐性狀基因位點，可W在苗期就鑒定出全褐果皮 的單株，進行早代篩查，不僅節約生產成本而且大大提高砂梨果實皮色性狀的選擇效率。
【具體實施方式】 陽0測 實施例1
[0039]砂梨'清香'果皮全褐性狀基因位點的分子標記的篩選方法，包括W下方法，