Dna標簽、pcr引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及核酸測序及分型技術領域，具體地，涉及DNA標簽、PCR引物及其應用， 更具體地，涉及一組DNA標簽、一組PCR引物、構建核酸測序文庫的方法、確定DNA樣品耳 聾基因是否存在突變的方法、用于確定DNA樣品耳聾基因是否存在突變的試劑盒W及確定 DNA樣品耳聾基因是否存在突變的系統。
【背景技術】
[0002] 耳聾是一種嚴重影響生活質量和交流的常見疾病。根據2006年第二次全國殘疾 人抽樣調查，我國殘疾人群8296萬，其中聽力殘疾人群2780萬，7歲W下的聾啞兒童高達 80萬，并W每年新生3萬聾兒的速度增長。嬰幼兒聾病發生60% -70%是由遺傳因素導致 的。迄今為止，與非綜合征型耳聾相關的40個常染色體隱性遺傳基因，27個常染色體顯性 遺傳基因，3個X連鎖遺傳基因，2個線粒體遺傳基因已經被克隆。而每個基因中又有數目 眾多的耳聾致病突變位點，其中WGJB2、化C26A4和12SrRNA的突變最為常見，其它基因所 占比例較小。
[0003]國內研究人員也針對中國人群耳聾的突變類型進行了大規模的流行病學調查。根 據近幾年的分子流行病學調查，上述3個基因和GJB3的突變比例高達40%。
[0004] 耳聾早期檢測的意義：第一時間發現聾病易感基因攜帶者及遲發型聽力損失高危 兒，做到早發現早干預；輔助耳聾病因診斷；檢測出藥物性耳聾基因攜帶者，指導抗生素的 應用，避免藥物性耳聾的發生；進行流行病學調查。因此耳聾突變基因的早發現對于聾病的 預防和治療具有重要意義。
[0005]目前傳統的耳聾基因檢測方法包括單鏈構象多態性（PCR-SSCP)，限制性片段長度 多態（PCR-RFLP)，變性高效液相色譜分析值HPLC)，直接測序，基因芯片、飛行時間質譜檢 測技術等方法。送些檢測方法存在較多局限性，或者檢測能力低、或者通量低耗時費力、所 需設備和耗材昂貴，更重要的是，送些方法除基因芯片的方法，難W同時將不同基因的多個 突變位點進行高通量的檢測，然而基因芯片的平臺價錢昂貴，對儀器和人員的素質要求較 高，難W在我國廣大醫療機構中普及。
[0006] 并且上文描述的郝些檢測方法，通量都較低。當對大規模的樣品進行耳聾基因檢 測時，應用上述方法是耗時耗力的，并且成本高昂。因此，本領域迫切需要新的高通量、低成 本的耳聾基因檢測方法，W實現快速檢測和規模化人群檢測。
【發明內容】
[0007] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種能夠高通量、低成本、快速高效地對DNA樣品尤其是多個DNA樣品進行耳聾基 因突變檢測的方法。
[0008] 因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一組DNA標簽。根據本發明實施例的 一組DNA標簽，其選自SEQIDNO:1-95所示的核巧酸。本發明的一組DNA標簽能夠用于 構建核酸測序文庫，W精確地對核酸測序文庫進行區分。利用上述DM標簽（在本文中有 時也稱為"核酸標簽"），通過將DNA標簽與DNA或其等同物相連，可W精確地表征DNA的樣 品來源。由此，利用上述DNA標簽，可W同時構建多種DNA樣品的用于測序的核酸測序文庫 (在本文中，有時也稱為DNA標簽文庫），從而可W通過將來源于不同樣品的核酸測序文庫 進行混合，同時進行測序，基于DNA標簽對獲得的測序序列進行分類，獲得多種DNA樣品的 序列信息。從而可W充分利用高通量的測序技術，例如利用Solexa測序技術，同時對多種 DNA進行測序，從而提高DNA測序的效率和通量。
[0009] 根據本發明的另一方面，本發明還提供了一組PCR引物。根據本發明實施例的一 組PCR引物，其選自SEQ ID NO =96-119所示的核巧酸。本發明的一組PCR引物分別與耳聾 基因GJB2、GJB3、SLC26A4和12S rRNA特異相關，利用該組PCR引物將DNA樣品進行多重 PCR擴增，能夠一步多重PCR擴增12個耳聾基因片段，經過測序即可快速獲取其DNA序列， 耳聾基因檢測通量高，突變位點分辨能力和靈敏度好。
[0010] 根據本發明的再一方面，本發明還提供了一組標簽PCR引物。根據本發明實施例 的一組標簽PCR引物，其是通過將前面所述的一組DNA標簽中的任意一種連接至前面所述 的一組PCR引物的5'末端而獲得的。因而，本發明的一組標簽PCR引物，可W有95種形式， 進而利用本發明的一組標簽PCR引物最多可W-次對95種DNA樣品進行耳聾基因的突變 檢測。
[0011] 根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種構建核酸測序文庫的方法。根據本 發明的實施例，該方法包括W下步驟：將DNA樣品進行多重PCR擴增，W便獲得PCR擴增產 物，其中所述多重PCR擴增采用前面所述的一組標簽PCR引物進行；W及純化回收所述PCR 擴增產物，所述PCR擴增產物構成所述核酸測序文庫。利用該方法，能夠有效地將根據本發 明實施例的DNA標簽引入到針對DNA樣品所構建的用于確定DNA樣品耳聾基因是否存在突 變的核酸測序文庫中，從而可W通過對核酸測序文庫進行測序，獲得DNA樣品的核酸測序 文庫的序列信息W及DNA標簽的序列信息，從而能夠對多種DNA樣品的核酸測序文庫的序 列信息的來源進行區分，進而能夠有效確定所述多種DNA樣品的每一種的核酸測序文庫的 序列信息，從而能夠分別確定多種DNA樣品耳聾基因是否存在突變，提高了耳聾基因突變 檢測的通量、效率和準確度。
[0012] 根據本發明的實施例，所述構建核酸測序文庫的方法進一步包括；將所述核酸測 序文庫依次進行末端修復、3'末端添加堿基A、連接測序接頭W及純化回收連接產物的步 驟。
[0013] 根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種確定DNA樣品耳聾基因是否存在突 變的方法。根據本發明的實施例，該方法包括W下步驟；根據前面所述的構建核酸測序文庫 的方法，構建所述DNA樣品的核酸測序文庫；對所述核酸測序文庫進行測序，W便確定所述 DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息；W及基于所述DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息， 確定所述DNA樣品耳聾基因是否存在突變。基于該方法，能夠有效地對DNA樣品進行耳聾 基因突變檢測，確定所述DNA樣品耳聾基因是否存在突變。
[0014] 根據本發明實施例，所述耳聾基因為GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少一 種。
[0015] 根據本發明的實施例，利用Solexa、SOLID、單分子和454測序平臺的至少一種對 所述核酸測序文庫進行測序。由此，測序通量高，檢測結果準確可靠。
[0016] 根據本發明的實施例，基于所述DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息，確定所述 DNA樣品耳聾基因是否存在突變，進一步包括；將所述DNA樣品的核酸測序文庫的序列信 息與參考數據庫進行比對；基于比對結果，確定所述DNA樣品耳聾基因是否存在突變。根 據本發明的一些具體示例，所述參考數據庫為耳聾基因數據庫，優選來自HGMD和http:// de曰fnessv曰ri曰tiond曰t曰b曰Se.com/o
[0017] 根據本發明實施例，所述DNA樣品為多種，所述多種為2-95種，所述方法包括W下 步驟；針對所述多種DNA樣品的每一種，分別獨立地根據前面所述的方法構建所述DNA樣 品的核酸測序文庫，其中，不同的DNA樣品采用相互不同的DNA標簽；將所述多種DNA樣品 的核酸測序文庫進行混合，W便獲得核酸測序文庫混合物；對所述核酸測序文庫混合物進 行測序，W便獲得所述多種DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息W及所述DNA標簽的序列 信息；基于所述DNA標簽的序列信息對所述多種DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息進行 分類，W便確定所述多種DNA樣品的每一種的核酸測序文庫的序列信息；W及基于所述多 種DNA樣品的每一種的核酸測序文庫的序列信息，分別確定所述多種DNA樣品耳聾基因是 否存在突變。由此，能夠同時構建多種DNA樣品的用于耳聾基因突變檢測的核酸測序文庫， 從而可W通過將來源于不同樣品的核酸測序文庫進行混合，同時進行測序，基于DNA標簽 對DNA樣品的核酸測序文庫的序列信息進行分類，獲得多種DNA樣品的核酸測序文庫的序 列信息。從而可W充分利用Solexa、SOLID、單分子和454測序平臺的至少一種，同時對多 種DNA進行測序和耳聾基因突變檢測，從而提高了檢測的效率和通量。
[0018] 根據本發明的實施例，基于所述多種DNA樣品的每一種的核酸測序文庫的序列信 息，分別確定所述多種DNA樣品耳聾基因是否存在突變，進一步包括：將所述多種DNA樣品 的每一種的核酸測序文庫的序列信息，分別與參考數據庫進行比對；基于比對結果，分別確 定所述多種DNA樣品耳聾基因是否存在突變。根據本發明的一些具體示例，所述參考數據 庫為耳聾基因數據庫，優選來自HGMD和ht1:p://deafnessva;riationdat油ase.com/。
[0019] 根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種用于確定DNA樣品耳聾基因是否存 在突變的試劑盒。根據本發明實施例的試劑盒，其包括；一組DNA標簽，所述DNA標簽選自 沈QIDNO:1-95所示的核巧酸；W及一組PCR引物，所述PCR引物選自沈QIDNO=96-119 所示的核巧酸。由此，利用該試劑盒，能夠方便地利用本發明的DNA標簽和PCR引物構建標 簽PCR引物，進而利用標簽PCR引物，根據本發明的確定多種DNA樣品耳聾基因是否存在突 變的方法，一次性最多能夠實現95種DNA樣品的耳聾基因突變檢測。
[0020] 根據本發明實施例，所述耳聾基因為GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA的至少一 種。
[0021] 根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種用于確定D