獲得9α-羥基雄烯二酮高產菌株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種獲得9a-徑基雄締二酬（9a-0H-AD)高 產菌株的方法。
【背景技術】
[0002] 醬體藥物作為僅次于抗生素的第二大藥物，人們對其的需求量不斷增加。醬體藥 物具有高效的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用，被廣泛用于治療風濕病、屯、血 管疾病、癌癥、皮膚病、內分泌失調、老年性疾病等。此外醬體藥物也被用來促進家畜的繁殖 及植物的生長。9a-徑基雄締二酬是醬體激素類藥物的重要中間體，利用9a-OH-AD作為 前體物可化合成氨化可的松、17a-OH黃體酬、依普利酬、0米松、地塞米松、可的松等多種 重要的醬體原料藥，具有重要的商業價值。
[0003] 目前，國內對9曰-OH-AD的合成都是從4-AD出發，通過多步化學合成得至IJ，反應過 程中存在化學工藝過程復雜、步驟繁瑣、累積產率低、產物成本高、底物消耗大等一系列問 題。目前，W生物轉化法催化合成醬體藥物越來越受到重視，從天然產物中取得含有留體基 本骨架的化合物如植物醬醇為原料，通過適當的微生物轉化來獲得。相較于傳統化學合成 方法，生物轉化法具有產率高、專一性強、條件較溫且環境友好等多種優勢，使其逐漸成為 醫藥工業合成醬體藥物的先進技術手段。近年來，利用微生物法制取9a-OH-AD的技術得 到充分發展并在工業上得到廣泛應用。
[0004] 微生物能在醬體的任何位置進行徑化反應，而化學方法除了較易在C17引入徑基 W外，在其他位置都很難引入。醬體微生物徑化反應無論在其多樣性或重要性方面都是獨 特的，因為其能達到其他方法不能達到的部位，無需要添加任何抑制劑就能有效的降解植 物醬醇的側鏈產生9a徑基AD，喪失了Cl, 2脫氨酶的活力，并使C9徑基化。
[000引但是，W醬體微生物為底物，利用微生物發酵制備9a-OH-AD的生物轉化效率較 低，因此，選育高產菌株是應用的關鍵。
【發明內容】
[0006] 本發明解決的技術問題在于提供一種獲得9 a-徑基雄締二酬高產菌株的方法， 得到遺傳性狀穩定的9a-OH-AD高產菌株。
[0007] 有鑒于此，本發明提供了一種獲得9a-徑基雄締二酬高產菌株的方法，包括W下 步驟：步驟a)W分枝桿菌菌株為出發菌株，將菌株在斜面培養基上預培養，然后將預培養 后的菌株制備成菌體濃度為1〇7~1〇8個/mL的第一菌懸液；步驟b)對所述第一菌懸液進行 紫外誘變，分離后培養，挑取單菌落進行活化和發酵；步驟C)W紫外（UV)誘變篩選出的菌 株制備第二菌懸液，對其進行亞硝基脈（NTG)誘變，分離后培養，挑取單菌落進行活化和發 酵，篩選后得到9a-徑基雄締二酬高產菌株。
[0008] 本發明對于所述出發菌株優選按照如下方法選擇：將分歧桿菌菌株在固體平板 中進行劃線分離，挑取生長較好的單菌落進行活化，于3rC、180r/min條件下振蕩培養 2-3天，取活化后的菌液按2%的接種量接種于種子培養基中，培養24h，當菌濃達到3-4% 時，按15%的接種量接種于發酵培養基中，發酵溫度為28°C，轉速為18化/min,發酵時間為 72-9化；經薄層色譜法（TLC)和高效液相色譜法（HPLC)對底物的轉化和產物的生成進行檢 測，選擇一株底物轉化率較高的菌株作為出發菌株。
[0009] 作為優選方案，所述分枝桿菌菌株為Mycobacterium sp. 0211。
[0010] 作為優選方案，所述步驟a)具體為：WMycobacteriumsp. 0211為出發菌株，用無 菌水沖洗Mycobacteriumsp. 0211斜面，沖洗液移入裝有玻璃珠的S角瓶中，于3TC、180 r/min條件下振蕩培養30min,稀釋后得到菌體濃度為1〇7~1〇8個/mL的第一菌懸液。
[0011] 優選的，所述UV誘變具體為：將功率為15W的紫外燈打開預熱20min，將第一菌懸 液置于紫外燈下30cm處，攬拌處理]~5min。
[0012] 優選的，步驟b)中發酵步驟具體為：將活化后的單菌落按15%的接種量接種于發 酵培養基中，底物為20g/l，發酵溫度為28°C，轉速為18化/min,發酵時間為72-9化。
[0013] 優選的，所述NTG誘變具體為：將NTG用丙酬進行溶解，并用憐酸鹽緩沖液配制成 濃度為2~6.Omg/血的溶液，加入所述第二菌懸液并對其進行水浴處理。
[0014] 優選的，步驟C)中，所述分離后培養步驟具體為：涂皿分離，在3rC下培養3-4天。
[0015] 優選的，步驟C)中，發酵步驟具體為：將活化后的單菌落按15%的接種量接種于發 酵培養基，底物為20g/l，發酵溫度為28°C，轉速為18化/min,發酵時間為72-9化。
[0016] 作為優選方案，步驟C)中，篩選采用的篩選培養基優選包括：植物醬醇1%，硝酸 鐘0. 1%，憐酸氨二鐘0. 05%，硫酸儀0. 05%，氯化鋼0. 05%，硫酸亞鐵0. 001%，瓊脂2%，抑值 7. 2。
[0017] 本發明優選對誘變后的菌株的轉化能力進行測定，采用的液體培養基優選為：葡 萄糖1%、牛肉膏0. 3%、蛋白腺0. 5%、抑為7. 0-7. 2 ;采用的固體培養基：葡萄糖1%、牛肉膏 0. 3%、蛋白腺0. 5%、瓊脂2%、抑為7. 0-7. 2。采用的種子培養基優選為：酵母粉9g/L、葡萄糖 4g/L、（畑4)2冊〇4〇.5g/l、蛋白腺1. 2g/L、化Cllg/L、消泡劑0.1 g/L、抑為6. 8-7. 2。采用的 發酵培養基優選為植物醬醇20g/l、大豆油lOOmL/1、玉米粉lOg/l、KN034g/l、胞2冊〇45g/ L胞&口〇45g/l、FeS(V7H2〇0. 03g/l、CaClz0. 06g/l、CuS〇40. 12g/l、尿素I. 2g/L、卵憐脂 0. 2g/l、消泡劑0. 05g/L，用化OH調抑為6. 8-7. 2。
[0018]本發明提供了一種獲得9a-?基雄締二酬高產菌株的方法，包括：W分枝桿菌 菌株為出發菌株，將菌株在斜面培養基上預培養，然后將預培養后的菌株制備成菌濃為 1〇7~1〇8個AiL的第一菌懸液；將第一菌懸液進行UV誘變，分離后培養，挑取單菌落進行活 化和發酵；W紫外誘變篩選出的菌株制備第二菌懸液，對其進行NTG誘變，分離后培養，挑 取單菌落進行活化和發酵，篩選后得到9a-OH-AD高產菌株。與現有技術相比，本發明得到 了遺傳性狀穩定的9a-OH-AD高產菌株，提高了采用微生物發酵方法制備9a-OH-AD時的 生物轉化效率，為進一步工業化生產奠定了良好的基礎。
[0019]
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明實施例2底物轉化過程中的化C圖； 圖2為本發明實施例2轉化結束后HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0021] 為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明優選實施方案進行描述，但是 應當理解，運些描述只是為進一步說明本發明的特征和優點，而不是對本發明權利要求的 限制。
[002引實施例1 :出發菌株Mycobacteriumsp. 0211的選擇和轉化能力的測定 1. 1 出發菌株Mycobacteriumsp. 0211 的選擇 將實驗室保藏的菌株（Mycobacteriumsp. 0211)在固體平板中進行劃線分離，挑取生 長較好的單菌落進行活化，3rC，180r/min振蕩培養2-3天，活化后的菌液按2%的接種量 接種于種子培養基，培養2地左右，當菌濃達到3-4%時，按15%的接種量接種于發酵培養基 中，發酵溫度為28°C、轉速為18化/min、發酵時間為72-9化。經TLC和HPLC對底物的轉化 和產物的生成進行檢測，選擇一株底物轉化率較高的菌株進行保存，作為出發菌株MO。
[0023] 1.2轉化能力的測定 TLC定性分析：用乙酸乙醋對發酵液進行萃取，充分振蕩混勻，用毛細管取上清液5化， 點硅膠板。W正己燒：乙酸乙醋=7:3為展開劑展開，當展開劑距離板的上側邊緣約Icm時 停止展開，自然風干，用硫酸噴涂，于l〇〇°C加熱套中加熱至顯色明顯。當醬醇被完全降解 時，停止轉化，對發酵液中的產物9a-OH-AD的含量進行測定。圖1為本實施例9a-OH-AD 轉化過程中的TLC圖。
[0024] HPLC對9 a -OH-AD含量的測定 制樣：取2mL發酵液，加入4血乙酸乙醋進行萃取，萃取兩次后合并萃取液并離屯、，得到 的上清液經旋轉蒸發W去除乙酸乙醋