磁性核-殼型離子液體固定化脂肪酶的制備方法及在食用油脂加工中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及脂肪酶催化劑，尤其是設及一種磁性核-殼型離子液體固定化脂肪酶 的制備方法，本發明還設及所制備的該脂肪酶在食用油脂加工中的應用。
【背景技術】
[0002] 脂肪酶是具有生物催化功能的生物大分子，與化學催化劑相比，具有反應條件溫 和、催化效率高、專一性強、副反應少等優點，廣泛應用于醫藥、化工、食品、輕工和環境保護 等行業。然而，游離脂肪酶操作穩定性差、易失活、不易重復使用，難W實現生產過程連續化 和自動化，而且反應后難W從反應體系中分離。雖然游離脂肪酶催化技術比較成熟，但真正 的工業化應用還是受到了很大的限制。
[0003] 酶的固定化是解決游離酶存在問題的主要方法之一，固定化脂肪酶不僅保持了酶 的催化活性，而且具有穩定性好、能重復使用、易從反應系統中分離、便于運輸和儲存、有利 于生產的連續化和自動化等優點。脂肪酶的固定方法有很多種，如交聯法、包埋法、共價結 合法和物理吸附法等。其中，交聯法是利用多功能交聯試劑與酶分子之間W共價鍵連接，從 而生成固定化酶。包埋法是將載體和酶溶液混合，加入引發劑，使其產生聚合反應，通過物 理作用，在載體的網格中限定酶，從而實現酶的固定化。載體偶聯法是載體表面的活性功能 基團和酶分子的非必需基團形成化學共價鍵，從而實現不可逆結合的酶固定方法，也被稱 之為共價結合法。采用運種方法可W牢固地連接載體和脂肪酶，所制得的固定化酶穩定性 和重復使用性較好。但是，運種方法存在有化學反應，會損失一定的活性。
[0004] 與上述方法相比，物理吸附法的特殊優勢在于其很好地保存了脂肪酶的空間構 象，相比游離脂肪酶，固定化酶的催化活性和專一性不會有顯著下降。此外，物理吸附法還 具有制備方法簡易等優點。然而，物理吸附法制得的固定化脂肪酶結合牢固度比化學鍵合 法差，催化劑穩定性不高。因此，如何提高物理吸附法制備固定化酶的穩定性受到了人們的 重視。
[0005] 載體的選擇是物理吸附法制備固定化酶的關鍵。近年來出現的介孔分子篩材料 是一種多孔型固體材料，它具有蜂窩狀的孔道，孔道尺寸為2~50nm。大多數介孔材料的 孔道都是規則有序排列的，具有層狀、六方對稱排列和立方對稱等結構，孔道尺寸也較為統 一，有利于脂肪酶的負載。相對于微孔分子篩，介孔材料較大的孔徑使其表面活性基團有較 好的可接近性，孔內可負載大體積基團，適用于體積大小范圍較寬的客體分子；此外，介孔 材料還具有較高的比表面積，理論負載量較高；介孔分子篩在酶催化反應過程中有較好的 化學惰性，不會影響催化反應中脂肪酶活性的發揮，同時也不會污染反應體系，在作為固定 化酶載體方面有較好的前景。然而，當此類介孔固定化酶在應用于高粘度物料體系(如油脂 醋醋交換反應體系）時，在反應結束催化劑分離的過程中，過濾速率十分緩慢，在一定程度 上制約了生產效率的提高。
[0006] 近年來，磁性納米粒子在各種固載化催化劑的制備中受到重視，W磁性材料為載 體制備的固體催化劑在完成催化反應后均可在外界磁場的參與下快速分離和回收，從而簡 化了催化劑分離工藝，大幅度提高了工業生產效率。同時，利用外部磁場可W控制磁性固定 化酶的運動方式和方向，可替代傳統的機械攬拌方式，提高固定化酶的催化效率。郭晨等將 離子液體（KnC(巧Im]Cl)負載于化3〇4磁性納米粒子，制成磁性離子液體復合材料固定化 酶體系，引入了離子液體微環境，提高了酶活性及穩定性；固定化酶成品在催化油酸與正下 醇的醋化反應中，催化活性為游離酶的1. 1~1. 2倍，重復使用5次后，仍能保持92%的活性。 (郭晨，高紅帥，江洋洋，劉春朝，劉會州.一種利用磁性離子液體復合材料固定化酶的方法 [P].中國專利：CN102250868A, 2011-11-23)。
[0007]然而，磁性納米粒子容易因磁吸引力而發生團聚，不易在反應體系中分散，阻礙了 脂肪酶催化活性的發揮。應用新興的"磁性粒子的包覆技術"將Si化介孔材料包覆于磁性 納米粒子表面，可制備"核-殼型磁性納米微球"。該磁性復合材料很好的繼承了磁性納米 粒子可磁分離的優勢，同時具有介孔材料高比表面積和易分散等諸多優點。盡管如此，在 Si化介孔材料的表面及孔道內壁具有許多娃徑基，運些娃徑基之間的氨鍵與靜電場力會干 擾酶的負載和催化反應時物料的傳質，繼而降低了固定化酶的催化活性。針對運些問題，不 少研究者在脂肪酶負載之前，先對載體進行了功能化修飾，W提高脂肪酶對載體的適應性。 Ab化11址等用=氨丙基乙氧基硅烷對介孔材料進行了修飾，然后進行權皺假絲酵母脂肪酶 的負載，成品固定化酶的脂肪酶負載量提高了 10%。該固定化酶在香茅醇與月桂酸的醋化反 應中表現出良好的催化活性(醋化率超過98%)，并在循環利用4次后，其活性仍能達到90% 從上（AbdullahAZ,SulaimanNS,KamaruddinAH.Biocatalyticesterification ofcitronellolwithIauricacidbyimmobilizedlipaseonaminopropy!-grafted mesoporousSBA-15[J].BiochemicalEngineeringJournal, 2009, 44 (2-3):263 -270)。然而，在較為復雜的油脂醋醋交換反應體系中，就載體修飾劑而言，可影響固定化脂 肪酶活性的因素有很多，如官能團種類、烷基鏈長度等，想要找出一種合適的修飾劑十分困 難。經過反復探索發現，離子液體作為一種結構和性能可控性較高的化合物，通過對其陰陽 離子的組合設計，可制備擁有較多物理W及化學特性巧日可調節的極性、兩親性、混溶性等） 的功能化離子液體。通過離子液體對載體的修飾，可W在一定程度上提高生物酶的適應性。 若用合適的離子液體對載體進行修飾后，再進行脂肪酶的負載可預期較好的負載效果。李 強等使用離子液體扣MIIM]扣M門對賴桿進行了修飾，改變了賴桿內部結構，增大了比表面 積，使生物酶的吸附點位增加，繼而得到多孔結構的載體，然后進行纖維素酶的固載。成品 固定化纖維素酶吸附量最高達到1800mg/g，固定化酶的表觀活性為45IU。該固定化酶可催 化纖維素降解，重復使用5次后，該載體固定化酶活性達到40%左右(李強，季更生，李斌， 屠潔，孟春鳳.一種用離子液體和修飾劑處理后的賴桿制備纖維素酶固定化載體的方法 [P].中國專利：CN103667243A，2014-03-26)。然而，賴桿載體的化學惰性較低，在較為復雜 的反應環境中其穩定性不足，重復使用性較差。
[0008] 隨著近年來食品工業的快速發展，功能性油脂和特殊使用性能的油脂制品需求量 越來越大(如人造奶油、起酥油、煎炸油和結構脂等)。油脂醋醋交換和油脂氨化是食用油脂 加工的重要化學反應。然而，由于氨化油脂中的反式脂肪酸會顯著增加食用者罹患屯、腦血 管疾病的風險，它的使用逐漸受到了限制。油脂醋醋交換不產生反式脂肪酸，不喪失必需脂 肪酸，而且能改善油脂的食用性能，生產出的油脂制品具有起酥性、可塑性、延展性和風味 好的特點。此外，通過油脂醋醋交換，結合新脂肪酸，W改變脂肪酸的位置分布，從而賦予其 烙化、消化、吸收和代謝功能，增加了其在食品營養和治療方面的食用功能。油脂醋-醋交 換反應中的催化劑在其中發揮著關鍵作用，所W研究開發新型油脂醋醋交換固定化酶催化 劑，對于食用油脂加工具有重要作用。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于針對上述現有技術所存在的缺陷，提供一種比表面積大、與產 物分離速度快、脂肪酶負載量大、催化活性和穩定性較高的磁性核-殼型離子液體固定化 脂肪酶的制備方法，本發明還提供所制備的該脂肪酶在食用油脂加工中的應用。
[0010] 為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案： 本發明所述的磁性核-殼型離子液體固定化脂肪酶的制備方法包括下述步驟： 第一步，化3〇4@mcm-41核殼型復合材料的制備 將Fe3〇4納米粒子、無水乙醇及蒸饋水一起加入到燒杯中，常溫下進行超聲分散，機械 攬拌條件下向混合溶液中滴加氨水，混合均勻后加入十六烷基=甲基漠化錠溶液，繼續攬 拌均勻，然后緩慢滴加正娃酸乙醋于反應體系中并繼續反應；當反應完成后，使用磁鐵對產 品進行磁分離，所得復合材料用無水乙醇洗涂、真空干燥；然后將其在55(TC條件下置于馬 弗爐中般燒化，得到核-殼型復合材料化3〇4@mcm-41 ; 第二步，載體的離子液體功能化修飾 取一定量的甲基咪挫和等摩爾的=氯丙基=乙氧基硅烷放入=口燒瓶中，氮氣保護， 95°C溫度下攬拌使之充分反應，然后將一定量第一步制備的核-殼型復合材料加入其中， 并加入一定量的乙醇為溶劑，氮氣保護下回流，反應結束后對產品進行磁分離；最后用無 水乙醇和乙酸分別洗涂數次，真空干燥后，得到離子液體修飾后的磁性復合載體IL-Fe3〇