一種pH穩定性提高的谷氨酸脫羧酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明公開了一種酸性穩定的谷氨酸脫簇酶（GAD)的抑穩定性向中性范圍偏移 的突變體，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002] 丫-氨基下酸（GABA)是廣泛存在動物、植物和微生物中的一種功能性非蛋白質天 然氨基酸，是脊椎動物中樞神經系統中的一種重要的抑制性神經遞質，具有鎮靜、抗驚厥、 增進食欲，促進消化、抗氧化等功能，對動物的抗熱應激能力、繁殖性能、激素分泌、禍體品 質有顯著影響。隨著對GABA研究的逐漸深入，其功能已經在各個領域得到了廣泛的應用， 尤其在食品及畜牧業中，對富含GABA的食品、飼料的開發及在動物生產中的應用已成為國 內外研究的熱點之一，因此，對GABA的研究具有較廣闊的前景。在哺乳動物體內GABA只存 在于神經組織中，由谷氨酸脫簇酶（Glutamatedecarbo巧Iase,GAD)轉化谷氨酸而成。研 究發現，乳酸菌、大腸桿菌W及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌種。 陽00引 目前，制備GABA的方法主要包括化學合成法和生物合成法，生物合成法又包括 植物富集法和微生物發酵法。化學合成法常用的有兩種：一種是W鄰苯二甲酯亞氨鐘和 丫-氯下氯在180°C反應，產物與濃硫酸回流水解，再經結晶提純而得；另外一種是W化咯 燒酬作為原料，經碳酸氨錠、氨氧化巧水解制得。最近，楊東元等采用一種新的方法，是W 丫-下內醋為起始原料，經氯化醋化反應生成4-氯下酸甲醋，再經氨解和皂化反應制得 GABA，總收率達57. 9%。運用化學合成法生產GABA雖然反應迅速，產品純度高，但是在生產 過程使用了危險溶劑，脫除產品中的有毒成分比較復雜且反應條件苛刻、能耗大、成本大， 其主要被應用于化工領域，在食品和醫藥領域中應用仍存在一定的安全隱患。
[0004] 大腸桿菌谷氨酸脫簇酶能催化k谷氨酸裂解為GABA和二氧化碳。植物富集主 要是轉化途徑谷氨酸經谷氨酸脫簇酶催化轉化合成GABA，是植物組織對外界條件應激代 謝所生成，雖然天然產物提取法在操作上簡單易行，但由于植物富集的GABA含量較低且分 離提取比較困難，所W不適合規模化生產。而微生物發酵法中谷氨酸脫簇酶（glutamate decar-bo巧lase，GAD)是特異性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已經被發 現存在于多種細菌和真核微生物。大腸桿菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用 于GABA規模化生產。谷氨酸脫簇酶能催化k谷氨酸裂解為GABA和二氧化碳，為提高生產 量研究者漸漸開始將研究重點轉向GABA限速酶一-谷氨酸脫簇酶（GAD)。通過克隆谷氨酸 脫簇酶基因并導入其它菌株來表達，W運種方式來提高發酵產GABA的能力。使GABA的產 量最終可達到2. 41g/l。而大腸桿菌谷氨酸脫簇酶（GAD)的最適抑過低，為3. 8-4. 5,酶分 子在抑高于6. 0時易發生解聚而失活，運限制了它的工業應用。由于工業生產GABA所用 底物為k谷氨酸鋼，該物質呈中性偏堿，為了達到k谷氨酸脫簇酶最適抑條件，生產時必 須向反應體系中加入大量的鹽酸或硫酸，運一方面造成了額外的原料成本和后續的廢水處 理成本，另一方面，酸性反應條件對于生產設備的腐蝕性大大增加，加速設備老化，降低了 生產設備的使用壽命，也增加了額外的成本。因此，在保持谷氨酸脫簇酶活性的基礎上，提 高其抑適應性成為工業生產的迫切需要。
[0005] 因此，本發明公開了一種酸性穩定的谷氨酸脫簇酶（GAD)的抑穩定性向中性范圍 偏移的突變體，將來源于植物乳桿菌GB01-21谷氨酸脫簇酶的谷氨酸脫簇酶編碼基因進行 定點突變，其特征在于所述定點突變的基因工程谷氨酸脫簇酶氨基酸序列相對于天然的谷 氨酸脫簇酶氨基酸序列的第89位的谷氨酸E分別突變為精氨酸R或丙氨酸A。本發明所述 的谷氨酸脫簇酶突變體分別在P冊.5時的相對酶活由原來的38%提高至72%或84%，在中 性抑范圍內的酶活穩定性顯著提高。本發明所得的谷氨酸脫簇酶突變體更加適合工業化 的生產需求，為高效合成丫-氨基下酸奠定了基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的問題是提供一種抑穩定性向中性范圍偏移的谷氨酸脫簇酶突變 體（GAD)。是將來源于植物乳桿菌GB01-21谷氨酸脫簇酶第91位的谷氨酸E進行定點突 變，分別突變為精氨酸R或丙氨酸A，將含突變后基因的重組質粒祀T28a-lpgad轉化進入 大腸桿菌中進行表達，得到谷氨酸脫簇酶分別在P冊.5時的相對酶活由原來的38%提高至 72%或84%的突變體。 陽007] 編碼所述突變后谷氨酸脫簇酶的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 所述突變是將第91位的谷氨酸E分別突變為精氨酸R或丙氨酸A。
[0009] 獲得所述突變體的方法，是W質粒祀T28a-lpgad為模版，設計引物，通過PCR進行 定點突變得到含有突變后基因的重組質粒祀T28a-lpga祀R，將祀T28a-lpga祀A轉化大腸 桿菌中表達。
[0010] 獲得所述突變體的方法，具體是：
[0011] (1)突變表達載體的構建
[0012] 通過分析谷氨酸脫簇酶的3D結構，確定91位的谷氨酸E為目的突變為點，設計突 變實驗，將該位點的谷氨酸分別突變為精氨酸R或丙氨酸A。
[0013]W質粒祀T28a-lpga祀為模板，根據待突變的氨基酸位點來設計PCR點突變引物， 通過重疊延伸PCR進行擴增，得到突變基因；之后分別與祀T28a和PXMJ19載體連接分別獲 得的重組質粒祀T28a-lpga祀X和pXMJ19-lpga祀X狂為突變后的氨基酸）；然后將此重組 質粒分別轉化到E.coli化21和谷氨酸棒桿菌C.glutamicuml3032菌株獲得重組菌株，提 取質粒進行測序。
[0014] (2)含突變體的基因工程菌的獲得
[0015] 制備E.coliBL2UDE3)感受態，將祀T28a-lpga祀X的連接液加入120yL的 E.COliBL2UDE3)感受態細胞中，篩選轉化子，并提取質粒測序驗證。
[0016] 制備C.glutami州ml3032感受態，將pXMJ19-lpga祀X的連接液加入120yL的 C.glutamicuml3032感受態細胞中，篩選轉化子，并提取質粒測序驗證。
[0017] (3)谷氨酸脫簇酶活力測定
[0018] 酶活測定方法：酶促反應總體積為500yL取490yLO. 2M的不同抑(3. 0~7. 0) 的緩沖液，其中含有0.OlmMPLP、IOOmMk谷氨酸鋼，加入10yL酶液，在反應之前分別把 緩沖液和酶液在40°C下預熱5min，然后混勻，在40°C下反應30min，最后迅速煮沸終止反 應，離屯、，用5%S氯乙酸燈CA)稀釋5倍，在4°C冰箱沉淀蛋白化左右，然后用HPLC檢測。
[0019] (4)重組菌發酵生產突變GABA
[0020] 將斜面保藏的菌種培養1化進行活化，再W5%的接種量接入500ml搖瓶（裝液 量為100mL)種子培養基中培養24h得到種子液，按10%的接種量將培養好的種子液接入 化全自動發酵罐，先于37°C、250r/min培養至0D600為0. 6,再向其中添加乳糖至終濃度 為IgA,同時在線控制P冊.8流加葡萄糖，30°C，誘導發酵14h至0D600為13. 6。將培養 好的菌體進行離屯、收集，雙蒸水洗涂=次，用乙酸-乙酸鋼緩沖液懸浮菌體，在優化后的轉 化條件下，W50g/L的投料量進行分批投料，，轉化2地，反應結束后轉化液離屯、取上清，加 入15%的=氯乙酸終止反應，取Im