一株高活性克拉維胺酸氨基乙酰化酶的棒狀鏈霉菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物育種和生物技術領域，具體設及一株高活性克拉維胺酸氨基乙 酷化酶的棒狀鏈霉菌及其應用。
【背景技術】
[000引克拉維酸（clavulanicacid)是臨床上常用的0-內酷胺酶抑制濟I，可與阿莫西 林或替卡西林聯合用藥，從而增強該抗生素對耐藥菌株的抗菌活性，提高臨床療效，具有重 要的臨床價值。
[0003] 克拉維酸是由棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)合成的一種次級代謝產 物，工業生產方式為微生物發酵和提取精制。目前發酵水平是決定克拉維酸生產成本的重 要因素，因此研發克拉維酸高產菌株具有非常重要的工業價值。野生型棒狀鏈霉菌的克拉 維酸產量很低，遠遠不能滿足工業發酵的需要，所W現有的棒狀鏈霉菌工業菌株都是通過 多輪誘變篩選得到的突變株，但是常規誘變育種技術具有隨機性和盲目性，導致育種工作 效率較低，周期很長，成為制約發酵工業生產技術提高的一個瓶頸。開發一種高效的棒狀鏈 霉菌育種方法并獲得高產菌株具有非常重要的實際應用價值。
[0004] 克拉維胺酸氨基乙酷化酶是從中間體克拉維胺酸轉向克拉維酸合成途徑的關鍵 酶，該酶活性提高時能夠提高克拉維胺酸轉向合成克拉維酸的催化效率，而酶活性降低時 克拉維胺酸會流向副產物。通過對克拉維胺酸氨基乙酷化酶進行基因改造可W有望獲得克 拉維酸高產菌，但由于基因改造的位點難W選擇，因此，目前尚未有關于對克拉維胺酸氨基 乙酷化酶進行基因改造而獲得克拉維酸高產菌的報道。
【發明內容】
[0005] 針對上述現有技術，本發明的目的是提供一株高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶的 棒狀鏈霉菌及其應用。采用定向進化的策略，對克拉維胺酸氨基乙酷化酶進行定向改造，并 配合高通量篩選技術獲得高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶，進而得到克拉維酸高產菌株。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 本發明的一個方面設及一種高活性克拉維酸氨基乙酷化酶，其具有如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
[0008] 本發明的另一方面設及編碼上述高活性克拉維酸氨基乙酷化酶的基因；具體的， 該基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 本發明的再一方面設及一種棒狀鏈霉菌，其含有上述編碼高活性克拉維酸氨基乙 酷化酶的基因。
[0010] 本發明的再一方面設及一株高活性克拉維胺酸氨基乙酷化酶的棒狀鏈霉菌，該菌 株具體為棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavulige;rus)B02-246。已于2015年10月13日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCCNO. 11484。
[0011] 本發明的棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)B02-246與工業菌株棒狀鏈 霉菌B02相比，克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因有4個堿基發生改變，分別是第1222位由 A變為G，第1229位由A變為T，第1239位由C變為A，第1240位由C變為G。其中第1222 位堿基突變引起密碼子由AAG變為GAG，氨基酸由賴氨酸變為谷氨酸；第1229位堿基突變 引起密碼子由GAC變為GTC，氨基酸由天冬氨酸變為鄉氨酸；第1239位堿基突變引起密碼 子由CTC變為CTA，是同義突變，氨基酸沒有變化，都是亮氨酸；第1240位堿基突變引起密 碼子由CAG變為GAG，氨基酸由谷氨酷胺變為谷氨酸。
[0012] 本發明的另一目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為棒狀鏈霉菌 (Streptomycesclavuligerus)B02-246。
[0013] 所述棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌劑在制備 克拉維酸中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0014] 進一步的，所述棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246和/或所述菌 劑在制備0-內酷胺酶抑制劑中的應用也是本發明的保護范圍。
[001引本發明的再一個目的是提供該棒狀鏈霉菌（Str巧tomycesclavuligerus)B02-246的制備方法，采用連續易錯PCR方法體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因，W 已有的克拉維胺酸氨基乙酷化酶缺失菌株為出發菌，通過接合轉移技術建立含有克拉維胺 酸氨基乙酷化酶基因的突變體庫，篩選獲得正突變株，最后通過發酵驗證、傳代培養獲得遺 傳性狀穩定的棒狀鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus)B02-246。
[0016] 本發明還有一個目的是提供一對用于體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的 易錯PCR的引物，其引物序列分別如序列表中SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。
[0017]上游引物Gcas化rward序列：GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG(SEQIDNO. 3);
[0018]下游引物GcasReverse序列：GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG(SEQIDNO. 4)。
[0019] 所述連續易錯PCR方法體外突變克拉維胺酸氨基乙酷化酶的基因的具體方法為：
[0020] (1)PCR反應體系：模板DNA2ul、PCR緩沖液加1、hqDNA聚合酶Iul、dATP 1~3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化l、25mM MgClzl~8ul、5mMMnClzO~Iul，補加超純水至 50ul。
[0021] 似PCR條件：預變性97°C10分鐘，變性97°C30秒，退火52~62°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環35次，終延伸10分鐘。
[0022] 第1次PCR的模板DNA來源于工業菌株棒狀鏈霉菌B02,第2次PCR及后續PCR的 模板DNA采用上次PCR產物。
[0023] 所述含有克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的突變體庫的構建方法，具體步驟如下：
[0024] (1)將連續易錯PCR產物用甜al和Ba恤I進行雙酶化凝膠瓊脂糖電泳分離后回 收酶切產物，并與同樣雙酶切的穿梭載體PSET152進行連接，轉化大腸桿菌D冊曰，挑取轉化 子提取質粒進行雙酶切鑒定，得重組PSET152 ;
[00巧](2)采用接合轉移技術將重組PSET152轉入工業菌株棒狀鏈霉菌B02的克拉維胺 酸氨基乙酷化酶基因缺失菌株，得到一系列接合子，即構建得到克拉維胺酸氨基乙酷化酶 基因的突變體庫。
[0026] 篩選正突變株所采用的方法為：采用平板透明圈法，對突變體庫中的接合子進行 高通量篩選。
[0027] 本發明的有益效果：
[0028] (1)本發明首次采用定向突變的方式篩選得到克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因的 突變體，通過連續易錯PCR在體外對克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因進行突變，同時通過高 通量篩選方法獲得克拉維酸高產菌株B02-246,克拉維酸合成水平比工業菌株棒狀鏈霉菌 B02高1. 3倍，可應用于工業化發酵生產，具有重要的經濟價值。
[0029] (2)本發明的棒狀鏈霉菌工程菌的制備方法，突變工作的效率高，針對性非常強， 降低了誘變育種的隨機性和盲目性，符合工業生產菌株的育種需要。
【附圖說明】
[0030] 圖1是平板透明圈法篩選棒狀鏈霉菌接合子；
[0031] 圖2是B02-246與B02的克拉維酸發酵水平比較。
【具體實施方式】
[0032] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[003引實施例1蟲續易錯PCR獲得含突變堿基的目的基因
[0034] 采用連續易錯PCR在體外對克拉維胺酸氨基乙酷化酶基因進行突變。具體為：
[003引 1.易錯PCR的引物為：
[0036]上游引物Gcas化rward序列：GCTCTAGAGCCCGCAGTGTGATGAAG;
[0037]下游引物GcasReverse序列：GCGAATTCGGGTGGCGTCTCCGCTCACG。
[0038] 2.PCR體系：模板DNA化1、PCR緩沖液加1、hqDNA聚合酶lul、dATP1 ~3ul、 dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化IJSmMMgClzl~ 8ul、5mMMnClzO~Iul,補加超純水至 50ul。
[0039] 3.PCR條件：預變性97°C10分鐘，變性97°C30秒，退火52~62°C30秒，延伸 72°C2分鐘，循環35次，終延伸10分鐘。
[0040] 第1次PCR模板DNA來源于工業菌株棒狀鏈霉菌B02,第2次PCR及后續PCR的模 板DNA采用上次PCR產物。
[0041] PCR產物直接送測序，結果顯示：當PCR體系中dATPlul、dTTPlul、dGTP化1、 dCTP化1、上游引物化1、下游引物化l、25mMMgCl26ul、5mMMnClzO.加1，PCR退火溫度為 58 °C，2次連續PCR時錯配堿基數為4~8，突變頻率比較適合進行定向改造。
[0042] 實施例2:棒狀鏈霉菌克拉維胺酸氨基乙酷化酶突變體庫的構建
[0043] 將實施例1中的連續易錯PCR產物用XbaI和BamHI進行雙酶切，凝膠瓊脂糖電泳 分離后回收酶切產物，并與同樣雙酶切的穿梭載體pSET152(pSET152為現有技術中的常規 質粒）進行連接，轉化大腸桿菌D冊a,挑取轉化子提取質粒進行雙酶切鑒定。