一種獲得高活力的里氏木霉融合纖維素酶的方法及重組菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體設及一種獲得高活力的里氏木霉融合纖維素酶的 方法及重組菌株。
【背景技術】
[0002] 植物來源的生物質產量高、種類豐富、可再生，在農業、工業上早已廣泛應用，也是 近年興起并快速發展的生物煉制生產生物燃料和高值化學品的理想原材料。植物生物質中 的多糖-纖維素和半纖維素-需要先被降解形成簡單的寡糖或單糖，方可被各種工程微生 物（如大腸桿菌、釀酒酵母和運動假單胞菌等）發酵、利用和轉化成目標分子。常綜合采用 物理（如高溫、高壓）、化學（如離子液）和生物（酶解）等多種方法W處理植物生物質并 高效降解纖維素和半纖維素。生物降解纖維素和半纖維素需要纖維素酶和半纖維素酶的協 同作用。近年來，雖然已有許多降解纖維素的新酶得到發現，但現在飼料、紡織和生物煉制 等許多行業中所使用到的纖維素酶仍然主要來自于絲狀真菌里氏木霉。
[0003] 里氏木霉的纖維素酶最適作用抑為5. 0,最適溫度為50度。里氏木霉纖維素酶的 結構域多W" 1個催化結構域+1個纖維素結合結構域"組織，采取單個、游離酶的策略來水 解纖維素。
[0004] 本發明對里氏木霉的纖維素酶系統進行工程改造，W期提高其降解纖維素的效 率，將里氏木霉的外切纖維素酶和內切纖維素酶行融合表達。
【發明內容】
陽〇化]本發明的目的是提供一種獲得高活力的里氏木霉融合纖維素酶的方法。
[0006] 本發明的再一目的是提供表達高活力的里氏木霉融合纖維素酶的重組菌株。
[0007] 根據本發明的獲得高活力的里氏木霉融合纖維素酶的方法包括在合適的宿主細 胞中融合表達來自里氏木霉的融合纖維素酶基因（cbhi-egl和cbhi-egll)的步驟。
[0008] 根據本發明的提高纖維素酶降解纖維素能力的方法，將CbhI基因片段和egl基因 片段、CbhI基因片段和egll基因片段串聯拼接，構建過表達cbhi-egl和cbhi-egll融合 基因的重組質粒，并將其轉入合適的微生物宿主細胞中進行表達。
[0009] 其中，CbhI基因片段的核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示：
[0015] 根據本發明的【具體實施方式】，設計引物，從里氏木霉TU-6的cDNA中擴增Cbhl基 因片段、egl基因片段和egll基因片段，然后通過Over-lapPCR的方法將Cbhl基因片段與 egl基因片段、egll基因片段分別進行連接，獲得cbhi-egl和cbhi-egll融合片段。同時 將融合片段和PPIC9 丫質粒載體分別進行SnaBI和NotI的雙酶切，電泳回收運S個片段。 將回收片段pPIC9 丫分別與cbhi-egl和cbhi-egll回收片段在DNA連接酶的作用下進行 連接，然后轉化大腸桿菌Transl感受態。挑取篩選平板上的轉化子，通過PCR及質粒測序 的方法驗證cbhi-egl和cbhi-egll分別成功重組到pPIC9 丫質粒上。將含有重組質粒的 轉化子接種，提取重組質粒PPIC9 丫 -C化I-egl和PPIC9 丫 -C化I-egll，然后轉化畢赤酵母 GS115菌株。通過測酶活的方法篩選到成功表達CBHI-EGI和CBHI-EGn融合蛋白的陽性轉 化子。表達融合纖維素酶CBHI-EGI和CBHI-EGII的轉化子在BMMY培養基中誘導培養2天 后，其纖維素酶的濾紙酶活分別為5583U/ymol和8405U/ymol;PASC酶活分別為：505抓/ ^111〇1和 142721]/^111〇1;〔1(：酶活分別為：119391]/^111〇1和 185941]/^111〇1;大麥葡聚糖的酶 活分別為：14023U/ymol和29783U/ymol;其活性均較單獨兩個酶的協同作用的酶活提高 了約1-3倍。
【附圖說明】
[0016]圖 1 顯示pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll重組質粒構建；
[0017]圖 2 顯示pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll重組質粒酶切驗證，M: DNA分子量；1，3, 5分別為：未酶切質粒pPIC9 丫，重組質粒pPIC9 丫 -ct)hl-egl，重組質 粒PPIC9 丫-cWiI-egll;2,4,6 分別為：被雙酶切的質粒PPIC9 丫，PPIC9 丫-cWiI-egl， pPIC9y-cbhi-egll；
[0018] 圖3顯示轉化子搖瓶發酵液的纖維素酶酶活測定，A:濾紙酶活；B:PASC酶活；C: CMC-Na酶活；D:大麥葡聚糖酶活。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1構建表達里氏木霉來源纖維素酶的重組質粒PPIC9丫-C化I-egl和 pPIC9丫-cbhl-egll
[0020] 構建pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll，經轉入畢赤酵母GSl15 菌株中，在 AOXl啟動子的驅動下，轉錄出mRNA，并翻譯成CBHI-EGI和CBHI-EGII融合蛋白。
[0021] pPIC9 丫-C化I-egl的質粒構建示意圖如圖I所示。 陽0。] CbhI基閑片段的擴蠟
[0023]W里氏木霉化-6 的cDNA為模板，WTrcbhl(SnaBI)F(5' -GGTACGTACAGTCGGCC TGCACTCTCCAATCGGAG-3'）和Trcbhl-eglR(5'-GGTACCCGGTTGCTGCAGGCACTGAGAGTAGTAAGG GT-3'）或Trcbhl-eg2R(5' -CCAGACAGTCTGCTGCAGGCACTGAGAGTAGTAAGGGT-3')為引物分別 對CbhI基因片段進行擴增。
[0024]PCR反應條件為：95°CX5min預變性；94°CX30s，55°CX30s，72°CXImin, 32 個 循環；72°CXlOmin;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的目的條帶，純化 DNA。 陽做]egl基閑片段的擴蠟
[0026]W里氏木霉化-6 的cDNA為模板，WTreglF巧'-TACTCTCAGTGCCTGCAGCAACCGGGTA CCAGCACCCC-3'）和Tregl(NotI)RG'-GGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGGCATTGCGAG TAGTAGTCGTTGC-3'）為引物對egl基因片段進行擴增。
[0027]PCR反應條件為：95°CX5min;94°CX30s，55°CX30s，72°CXlmin，32 個循環； 72°CXlOmin;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的目的條帶，純化DM。 陽0巧]egll基閑片段的擴蠟
[0029]W里氏木霉化-6 的cDNA為模板，WTreg2F保-TACTCTCAGTGCCTGCAGCAGACTGTCT GGGGCCAGTGT-3')和Treg2(NotI)RG'-GGGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTTCTTGCGAG ACACGAGCTGACC-3')為引物對egl基因片段進行擴增。
[0030]PCR反應條件為：95°CX5min;94°CX30s，55CX30s，72°CXlmin，32 個循環； 72°CXlOmin;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的目的條帶，純化DM。
[0031] dPIC9Y-cMiI-egl巧dPIC9Y-cMiI-egll質粒的構律
[0032] 將從里氏木霉TU-6的cDNA中擴增所得到的Cbhl基因片段和egl基因片段或 egll基因片段通過Over-lapPCR的方法，將Cbhl基因片段與egl基因片段、egll基因片 段分別進行拼接，獲得cbhi-egl和cbhi-egn融合片段。同時將融合片段和PPIC9 丫質粒 載體進行SnaBI和NotI的雙酶切，電泳回收運S個片段。將回收片段PPIC9 丫分別與 cbhi-egl和cbhi-egll回收片段按3:1的摩爾比，在DNA連接酶的作用下進行連接，然后 轉化大腸桿菌Transl感受態。挑取篩選平板上的轉化子，通過PCR及質粒測序的方法驗證 cbhi-egl和cbhi-egll分別重組到pPIC9 丫質粒上，成功獲得重組質粒pPIC9 丫 -ct)hl-egl 和PPIC9 丫-C化I-egll(如圖1所示）。將含有重組質粒的轉化子接種于50ml含有氨節的 LB培養基中，并于37°C，180巧m培養16h。提取重組質粒，備用于轉化。
[0033] 實施例2.重組質粒pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll雙酶切驗證
[0034]將PPIC9 丫 質粒，PPIC9 丫 -cWiI-egl重組質粒和PPIC9 丫 -cWiI-egll重組質粒分 別進行SnaBI和NotI雙酶切；20y1的反應體系：1y1的SnaBI，1y1的NotI，2y1的 lOXbuffer，10y1的質粒和6y1的(1地2〇,在30°C水域中反應化。取3y1的酶切產物和 未酶切的質粒，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，酶切質粒均出現和預期一致大小的DNA條帶 (如圖2所示）。
[0035] 實施例 3.將pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll質粒轉化畢赤酵母GS115 菌株及陽性轉化子的篩選
[0036] 畢赤酵母GSl 15蔭株的轉化
[0037]將pPIC9 丫 -cWiI-egl和pPIC9 丫 -cWiI-egll質粒轉化畢赤酵母GS115 菌株。
[0038] 轉化子的誘導培養
[0039]用滅菌的牙簽挑取MD板上的轉化子，按次序將帶菌體的牙簽內置3ml的BMGY培 養基的離屯、管中，在30°C、220rpm搖床中振蕩培養4她；將離屯、管中培養的菌液W4, 50化pm 離屯、5min，輕柔棄上清，向菌體中加入Iml的BMMY培養基，在30°C、220rpm搖床中誘導培養 4她；將誘導的轉化子的培養液轉移至2血邱pendcxrf管中，12, 00化pm離屯、2min，收集上清 液（即發酵液），備用于纖維素酶的酶活檢測，篩選出有酶活力的表達菌株。 W40] 所述MD培養基的成分包括：2%葡萄糖，20%瓊脂糖，115°C滅菌30min，冷卻后加 入相應體積濾滅的10XYNB(13. 4mg/ml)和1000 X生物素0). 4mg/ml);
[0041] 所述BMGY培養基的成分包括：2%蛋白腺，1%酵母粉，1%甘油，121°C滅菌20min， 冷卻后加入相應體