一種雞C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物動物疫苗領域，具體設及一株雞C型禽偏肺病毒及其相關應 用。
【背景技術】
[0002] 禽偏肺病毒（aMPV)是一種新發現的重要的禽類呼吸道疾病的病原，在火雞和雞 等禽類上引起的急性、高度傳染性上呼吸道感染，引起種雞和產蛋雞產蛋量急劇下降，并且 影響蛋殼的質量。該病毒屬于副黏病毒科偏肺病毒屬，在負差電子顯微鏡下觀察到的禽偏 肺病毒為多邊，楠圓形，常見直徑為80-200皿，偶爾會有大量長絲狀的形態存在，長度可達 lOOOnm。禽偏肺病毒有A、B、C、D四個亞型。2012年我們在我國東南部首次發現雞C型禽 偏肺病毒感染。在流行病調查中顯示我國不管是地方品種，還是國外引種的白羽雞，aMPV感 染都普遍存在。
[0003]aMPV具有極高傳染性，傳播速度快，還可造成免疫抑制反應，常伴隨細菌繼發性感 染，可使感染禽類死亡率增加25% -40%，對養殖業造成嚴重的經濟損失。目前我國還沒有 針對禽偏肺病毒感染的疫苗。在我們調查研究過程中，數家企業由于C型禽偏肺病毒感染 造成肉種雞和大齡蛋雞生產性能大幅下降，不得不對其進行淘汰，損失巨大。由于雞C型禽 偏肺病毒為我國首次報道，目前我們主要通過對SPF雞或者雞胚進行分離培養和鑒定，但 是運并不能完全滿足開展病毒致病機制和疫苗等相關研究的需求。本發明利用非洲綠猴腎 細胞Vero深入研究病毒的體外細胞培養特性發現，最初體外培養并不產生明顯病變，經過 連續傳代和馴化，獲得一株細胞適應病毒。經間接免疫巧光、透射電鏡及蛋白質印跡法證實 分離株為雞C型禽偏肺病毒aMPV/C-JCX，為下一步深入開展aMPV疫苗研究提供了物質材 料。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一株細胞適應性的雞C亞型禽偏肺病毒，本發明的目的還 在于提供所述禽偏肺病毒的應用。
[0005] 為實現上述目的，本發明通過將野外分離的雞C型禽偏肺病毒在Vero細胞上 連續傳代，獲得了一株毒力減弱的細胞適應毒株aMPV/C-JCX，該病毒已于2015年6月 24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽區北辰西 路1號院，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為禽偏肺病毒（Avain metapneumovirus)，保藏號為CGMCCNo. 10900。
[0006]本發明病毒是收集國內首次分離到的雞C型禽偏肺病毒感染病雞組織研磨液，接 種貼壁生長的單層非洲綠猴腎細胞Vero,細胞培養物作為下一輪傳代的接種物，依次連續 傳代獲得一株細胞培養適應毒株。在適應過程中，早代次培養周期為7-9天，傳至60代后 縮短至3-5天可W觀察到明顯的細胞病變。經過透射電鏡、間接免疫巧光和蛋白質印跡法 證實該細胞能夠有效的培養C型禽偏肺病毒。病毒透射電子顯微鏡下觀察到病毒粒子呈圓 形，直徑約170皿。病毒的滴度IgTCIDSO= 10 4'2/0. 1ml。經過SPF雞證實該病毒毒力較 弱，具有良好的免疫原性和保護性，該細胞適應病毒毒株是生產病毒疫苗理想候選毒株。
[0007] 進而，本發明還提供所述的雞C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX在制備防治禽偏肺 病毒感染引起的疾病的疫苗中的應用。所述禽偏肺病毒感染引起的疾病可W是禽偏肺病毒 感染引起上呼吸道疾病或-產蛋下降等。可W用所述的雞C型禽偏肺病毒毒株aMPV/C-JCX 制備疫苗生產毒種。
[0008] 本發明的有益效果是提供了一株細胞適應毒株aMPV/C-JCX，該毒株可用于制備中 疫苗生產毒種，制備疫苗，用于防治禽偏肺病毒感染引起的疾病。
【附圖說明】
[0009] 圖1是免疫巧光的檢測結果圖，在巧光顯微鏡下觀察發現，感染aMPV/C-JCX的 Vero細胞（圖A)中可見明顯的內巧光染色，而正常未接種細胞（圖B)無巧光出現。
[0010] 圖2是Western Blot檢測實驗結果圖，使用特異性的病毒蛋白作為一抗，Western Blot檢測不同接種時間病毒蛋白的表達發現，接毒細胞在48KD處有明顯的蛋白條帶。
[0011] 圖3病毒形態圖，在透射電子顯微鏡下觀察到的病毒粒子呈圓形，直徑約170皿。 [001引圖4aMPV-JCX接種后并未引起雞胚發育受阻，圖A表示接種aMPV-JCX，B表示接 種PBS(對照組）。
【具體實施方式】
[0013] W下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[0014] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0015] 實施例1aMPV/C-JCX毒株的獲得及鑒定
[0016] 1.出發病毒aMPV/C-JCZ
[0017] 出發病毒為aMPV/C-JCZ，該病毒已于2015年6月24日在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究 所，郵編100101)保藏，分類命名為禽偏肺病毒（Avainmetapneumovirus)，保藏號為CGMCC No.10889。
[0018] 根據Reed-Muench法計算病毒的EID50, 1姐ID50 = 10 4'V〇. 2ml。通過回雞試 驗證實由aMPV/C-JCZ單獨感染即可引起商品代黃羽肉雞嚴重的呼吸道癥狀；肺部和氣管 的病理檢查發現，病毒感染引起嚴重的炎性病理損傷。
[0019] 使用QiagenRNeasyMiniKit提取病毒總RNA，使用SuperScriptTMIIIKit[^及 M基因特異性引物，合成的禽偏肺病毒CDNA為模板進行RT-PCR擴增，擴增產物W瓊脂糖凝 膠電泳檢測，回收后連接在T載體上，克隆成功后由上海生工生物工程技術有限公司進行 測序。M基因（SEQIDNo. 1)和GenBank上登記的A、B、C亞型禽偏肺病毒，依據MEGA5. 10 和DNAstar軟件進行序列同源性比較和構建系統發育樹，發現aMPV-JCZ與C型禽偏肺病毒 同源性為96. 0% -96. 7%，而與A和B型只有70. 6% -71. 7%的同源性。
[0020] 2、獲取病毒樣品
[0021] 收集呼吸道癥狀的病雞鼻甲骨、氣管、喉頭和肺組織樣品，研磨后在PBS中重懸， 3500巧m/min離屯、15分鐘，上清使用0. 22ym過濾器除菌后保存在-80°C。
[0022] 3、病毒在Vero細胞上盲傳和適