一種將t淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種將Τ淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法。
【背景技術】
[0002]胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs，簡稱ES、ΕΚ或ESC細胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內環境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。胚胎干細胞在組織工程與再生醫學等領域極具應用價值。
[0003]作為被稱之為“種子細胞”的ES細胞，為臨床的組織器官移植提供大量材料。人ES細胞經過免疫排斥基因剔除后，再定向誘導終末器官以避免不同個體間的移植排斥。這樣就可能解決一直困擾著免疫學界及醫學界的同種異型個體間的移植排斥難題。ES細胞可用于細胞治療，細胞治療是指用遺傳工程改造過的人體細胞直接移植或輸入病人體內，達到治愈和控制疾病的目的。ES細胞經遺傳操作后仍能穩定地在體外增殖傳代。以ES細胞為載體，經體外定向改造，使基因的整合數目、位點、表達程度和插入基因的穩定性及篩選工作等都在細胞水平上進行，容易獲得穩定、滿意的轉基因ES細胞系，為克服目前基因治療中導入基因的整合和表達難以控制，以及用作基因操作的細胞在體外不易穩定地被轉染和增殖傳代開辟了新的途徑。
[0004]然而，由于其難以獲得且涉及敏感的倫理問題，使得研究一度陷入尷尬境地。2006年8月，日本Yamanaka研究小組向小鼠成纖維細胞內導入4種轉錄因子基因(0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，成功地將其重編程為ESCs樣誘導性多能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。2007 年底，日本 Yamanaka 小組和美國 Thomson小組相繼將這一革命性技術在人類細胞中得以實現。iPSCs的研究是一項具有開創性治療性克隆的基礎研究，避開了長期以來ESCs難以獲取且極易引發倫理爭議的問題，為干細胞醫學應用開辟了一條新的途徑，被認為是干細胞領域乃至整個生物學領域的重大發現。包括英國愛丁堡大學Ian ffilmut教授在內的許多科學家均認為誘導性多能干細胞才是干細胞未來的研究方向。iPSCs細胞不僅對于干細胞研究具有重要的理論意義，而且在細胞治療、組織器官再生、藥物篩選與評價等領域極具應用價值。
[0005]然而，iPSCs的安全性是臨床應用前必須考慮的問題。用于介導目的基因的多數病毒載體可整合到靶細胞基因組中，有可能激活癌基因。為消除iPSCs的安全隱患，研究人員一直在尋求一種更安全的轉錄因子導入方式。
【發明內容】
[0006]有鑒于此，本發明提供了一種將T淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法。該方法可成功獲得多能干細胞，安全性高，且轉化率和純度均較高。
[0007]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0008]本發明提供了一種將T淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法，包括如下步驟:
[0009]將含有干細胞轉錄因子基因的仙臺病毒轉染T淋巴細胞，獲得感染細胞；
[0010]將感染細胞與飼養層細胞混合，進行第一培養，采用人胚胎干細胞培養基進行第二培養，然后采用飼養層細胞的條件培養基和人胚胎干細胞培養基的混合液進行第三培養，最后采用人胚胎干細胞培養基進行第四培養，獲得多能干細胞。
[0011]第一培養具體為:將感染細胞與飼養層細胞混合，采用飼養層細胞培養基進行培養，然后棄飼養層細胞培養基。
[0012]本發明以仙臺病毒為轉染載體，以外周血T淋巴細胞為供體細胞，先將感染細胞與飼養層細胞混合培養后，采用人胚胎干細胞培養基進行培養，然后采用條件培養基和人胚胎干細胞培養基的混合液進行培養，最后采用人胚胎干細胞培養基進行培養，成功獲得多能干細胞，其多能干細胞的轉化率和純度均較高。
[0013]在本發明提供的一些實施例中，干細胞轉錄因子為0CT4、S0X2、C-MYC或KLF4中的一種或兩種以上的混合物。
[0014]作為優選，轉染為在37°C條件下轉染24?36h。
[0015]優選地，轉染為在37°C條件下轉染24h。
[0016]在本發明提供的一些實施例中，條件培養基的配方為:P2代MEF細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)的培養上清液。
[0017]在本發明提供的一些實施例中，胚胎干細胞培養基為人胚胎干細胞培養基。
[0018]在本發明提供的一些實施例中，人胚胎干細胞培養基的配方為:DMEM/F12，血清替代物，β -硫基乙醇，1%非必需氨基酸，FGF，堿性成纖維生長因子。
[0019]作為優選，條件培養基與胚胎干細胞培養基的體積比為1: (1?1.5)。
[0020]優選地，條件培養基與胚胎干細胞培養基的體積比為1:1。
[0021]作為優選，轉染采用的助轉劑為polybrene。
[0022]作為優選，第一培養的時間為1天，第二培養的時間為9?11天。
[0023]優選地，第二培養的時間為9天。
[0024]作為優選，第三培養的時間為8?10天，第四培養的時間為7?15天。
[0025]優選地，第三培養的時間為8天，第四培養的時間為7天。
[0026]本發明提供了一種將T淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法。該方法包括步驟:將含有干細胞轉錄因子基因的仙臺病毒轉染T淋巴細胞，獲得感染細胞；將感染細胞與飼養層細胞混合，進行第一培養，采用人胚胎干細胞培養基進行第二培養，然后采用條件培養基和人胚胎干細胞培養基的混合液進行第三培養，最后采用人胚胎干細胞培養基進行第四培養，獲得多能干細胞。本發明至少具有如下優勢之一:
[0027]1、本發明選擇仙臺病毒作為轉染載體，避免病毒的基因組整合到供體細胞的基因組中，提高了 iPS細胞的安全性；
[0028]2、本發明選擇外周血T淋巴細胞作為iPS細胞的供體細胞，供體細胞來源簡單；
[0029]3、本發明以仙臺病毒為轉染載體，以外周血T淋巴細胞為供體細胞，先將感染細胞與飼養層細胞混合培養后，采用人胚胎干細胞培養基進行培養，然后采用條件培養基和人胚胎干細胞培養基的混合液進行培養，最后采用人胚胎干細胞培養液進行培養，可成功獲得多能干細胞，其多能干細胞的轉化率和純度均較高，為將iPS細胞應用于免疫系統疾病或腫瘤免疫細胞治療奠定一定的理論基礎。
【附圖說明】
[0030]圖1示獲得的iPS細胞的形態；
[0031]圖2示堿性磷酸酶染色結果。
【具體實施方式】
[0032]本發明公開了一種將T淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0033]術語解釋:
[0034]誘導多能干細胞(inducedpluripotent stem cells，iPS cells):通過一定的途徑將與細胞多能性有關的基因導入到已分化的體細胞中，或者同時添加一些輔助作用的小分子化合物使體細胞去分化重編程回到胚胎干細胞狀態，所獲得的細胞為iPS細胞。
[0035]本發明提供的將T淋巴細胞誘導成多能干細胞的方法中所用試劑、儀器均可由市場購得。
[0036]條件培養基的配方為:P2代MEF細胞培養時，收集的培養MEF細胞的培養上清，即為條件培養基；
[0037]人胚胎干細胞培養基的配方為:89%人胚胎干細胞培養液-knockout? DMEM/F12 (Gibco) +knockout? serum replacement (KSR) (KnockOut 血清替代物；Gibco) + β -硫基乙醇+1 % NEAA(非必需氨基酸)(Sigma)+10ng/mL basic FGF, recombinant human(喊性成纖維生長因子)(PeproTech)；
[0038]助轉劑:polybrene。
[0039]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0040]實施例1誘導多能干細胞的制備
[0041](1)總T淋巴細胞的分離和分選
[0042]1)將抗凝管中的外周血轉移到離心管中，400-500g(離心力)離心5-lOmin，離心結束后將下層血細胞轉移到50mL離心管中，加入兩倍體積的生理鹽水進行稀釋；
[0043]2)取一支新的s印mate離心管(購自STEM CELL公司)，加入Ficoll淋巴細胞分離液(購自STEM CELL公司)12mL，將稀釋后的血細胞轉移到sepmate離心管，600_800g離心 15_20min ；
[0044]3)離心后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進行洗滌1次；
[0045]4)用⑶3+分選試劑盒(購自STEM CELL公司)將T淋巴細胞從上述單個核細胞分選出來。
[0046](2)飼養層細胞的準備
[0047]1)將P2代的MEF細胞復蘇；
[0048]2)待MEF細胞(小鼠胚胎成纖維干細胞)融合率達到80?90 %時，將MEF細胞進行傳代。然后將1-3X105的細胞接種到六孔板中；
[0049]3)第二日用5-20 μ g/mL的絲裂霉素C進行處理2小時；
[0050]4) 2小時后換成MEF培養基，獲得飼養層細胞。
[0051](3)仙臺病毒轉染和iPS細胞的培養
[0052]1)按照仙臺病毒重編程試劑盒操作:將含有0CT4、S0X2、C-MYC和KLF4的仙臺病毒溶液加入六孔板中，溶液體積最后補足至2mL，最后加入2 μ L5?20 μ g/mL的助轉劑，將整個體系混勻后，轉移到已經預包被好的6孔板的一孔中，搖勻后放入37°C培養箱中，過夜。
[0053]2)病毒感染24小時后(第1天)，將昨日感染的細胞鋪到事先準備好的飼養層細胞上。
[0054]3)第2天，將DMEM高糖培養基換成人胚胎細胞培養液，繼續培養。以后每2天換液一次。
[0055]4)逐日觀察，待細胞長至第5?7天時，可見小的細胞聚集，細胞形態已經明顯發生了改變，生長聚集在一起。
[0056]5)直至第10天，由于MEF細胞使用時間過長，故培養液換成CM (condit1nedmedium，條件培養基)+hESC(人胚胎干細胞)正常培養液的1:1 (體積比)混合液，以提供給細胞充足的營養。
[0057]6)待細胞長至第18天，可以挑克隆，將胚胎干細胞樣的克隆挑至新的MEF上，按hESC (人類胚胎干細胞)培養方法繼續培養7天，擴增。iPS細胞克隆與正常的人類胚胎干細胞在形態上基本無異(圖1)。
[0058]將上述獲得的細胞進行iPS細胞的