維持愛德華氏菌抗原免疫保護力的精確滅活方法及其滅活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及魚用疫苗的精確滅活技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種維持愛德華氏菌抗原免 疫保護力的精確滅活方法及其滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]愛德華氏菌巧dwardsiellaspp.)屬于腸桿菌科，包括遲緩愛德華氏菌 巧.tarda)、站魚愛德華氏菌巧.ictaluri)和保科愛德華氏菌化hoshinae)3個種，其 中遲緩愛德華氏菌和站魚愛德華氏菌是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要病原菌之一，并在世界 范圍內(nèi)對多種養(yǎng)殖魚類中引發(fā)了病害并造成了巨大損失。遲緩愛德華氏菌可感染的 魚類有：斑點叉尾綱（Ictaluruspunctatus)、大 口黑驢（Micropterussalmoides)、島曼 綱（Anguillajapanica)、離魚（MugilCe地alus)、準齒觸巧vynnisjaponica)、羅非魚 (Tilapianilotica)、奇努克魚圭魚(Oncorhynchustshawytscha)、紅觸(Chrysophrys major)、五條飾（Seriolaquinqueradiata)、牙魚平（Paralichthysolivaceus)、魚里魚 (Cyprinuscarpi〇)、海食盧（Moronesaxatilis)、大菱魚平（Scophthalmusmaximus)、古月餘 (Clariasbatrachus)、錦經(jīng)（An油astes1:udineus)、歐洲媛（AnguiIlaanguilla)、黃顯魚 (Pelteobagrusfulvidraco)、絲足魚（Trichogastertrichopterus)、地圖魚（Astronotus ocellatus)、劍尾魚狂ipho地orushelleri)和斑馬魚值aniorerio)等。該菌株另也有 感染兩棲類（贍餘、牛蛙等）、爬行類（姍賜、蛇、海龜、中華整等）、鳥類（企碟、秀鷹、駝鳥 及一些水鳥等）、哺乳類（海獅、海牛、豬、狗、牛、猴子等）的報道。除W上動物外，該菌株 可感染人類，引起人的腸胃炎、流行性腹瀉和敗血癥等癥狀；站魚愛德華氏菌可感染的魚類 有：斑點叉尾綱（Ictaluruspunctatus)、藍It魚（Ictalurusfurcatus)、步行It(Clarias batrachus)、云斑綱（Ameiurusnebulosus)、黃顯魚（Pelteobagrusfulvi化aco)、淡水藍 整（Pangasiushypo地thalmus)、青色埃氏電媛巧igenmanniavirescens)、玫瑰無須觸 (Puntiusconchonius)、蟲工魚尊（Oncorhynchusmykiss)、香魚（Plecoglossusaltivelis) 和斑馬魚值aniorerio)等。目前對保科愛德華氏菌的報道較少，已報道的感染宿主為鳥類 (如火烈鳥、海雀等）、禽類（如鶴譜等）和爬行類（如姍賜等）。目前在疾病防治中常采 用化學(xué)治療劑W及抗生素，但隨著它們的使用，病原耐藥性也隨之增強，而且藥物殘留和在 環(huán)境中的擴散已經(jīng)引起了食品安全、環(huán)境及公共衛(wèi)生方面的問題。疫苗使用后不會產(chǎn)生污 染，不會在免疫機體內(nèi)形成殘留，可W避免環(huán)境污染并維持機體本身的品質(zhì)，反復(fù)使用也不 會產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] 魚用疫苗按制作方法來區(qū)分其種類包括滅活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗、菌蟻 疫苗或減毒活疫苗等；滅活疫苗研發(fā)周期短、制作成本低、安全性好，在免疫效率得到保 證的情況下最容易獲得批準，因此成為目前商業(yè)化疫苗的最主要種類。但研究表明，愛德 華氏菌與其他病原菌不同，常規(guī)滅活疫苗所產(chǎn)生的免疫保護效果的報道模棱兩可（Thune 化等，1997.DevBiolStand. 90:125-1:34.)，Gutierrez和Miyazaki(1994,DisAquat 化g. 6:110 - 117.)研究中福爾馬林滅活的遲緩愛德華氏菌注射免疫日本媛的相對保護率 僅為12. 5-25%，我們前期實驗采用未經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)技術(shù)制作的愛德華氏菌滅活疫苗的相 對保護率（RP巧也不到 40%;Mekuchi等（1995,FishPathol. 30(4) :251-256)分別采用肌 肉注射、浸泡或口服的接種方式用福爾馬林滅活的遲緩愛德華氏菌免疫牙解，但均沒有取 得有效的免疫保護效果。Sun等（2011，F(xiàn)ishSiellfishImmunol. 31(4):595-599.)雖然 也報道了愛德華氏菌的滅活疫苗，愛德華氏菌的單價滅活疫苗的免疫保護率只有33. 3%， 只有當(dāng)滅活的愛德華氏菌與媛弧菌等另=種菌聯(lián)合使用時，才能獲得較好的免疫保護率， 媛弧菌等其他=種菌滅活疫苗其實為愛德華氏菌滅活疫苗起到了免疫佐劑的作用?？傮w來 說，結(jié)合我們自己的多次實驗結(jié)果W及大多數(shù)的報道，愛德華氏菌滅活疫苗的免疫效果不 盡理想，運也可能是人們不得不花更大的代價進行其他種類的疫苗的研究的原因。
[0004]上述Gutierrez等的研究中表明愛德華氏菌的脂多糖（LP巧的免疫效果好 于其福爾馬林滅活的疫苗，不過也只達到37-50%。Klesius等（2000)的發(fā)明扣S 化tent6153202)公開了一種餘魚愛德華氏菌減毒活疫苗，Klesius等（2000)的發(fā)明扣S Patent6019981)公開了一種基因修飾的餘魚愛德華氏菌活疫苗，Evans等（2006)的發(fā)明 扣SPatent7067122)公開了一種基因修飾的遲緩愛德華氏菌的活疫苗。運些專利說明減 毒疫苗在愛德華氏菌疫苗研究中得到了更多的重視。減毒疫苗雖然能保證愛德華氏菌疫苗 的免疫保護率，但由于減毒疫苗仍然存在一定的生物安全風(fēng)險，在安全性評價上需要更為 謹慎，使得運種疫苗研制和實現(xiàn)商業(yè)化的周期長，代價高。由于不同疫苗都存在一定的特異 性，一旦有不同種或不同血清型的愛德華氏菌的威脅，運種減毒疫苗可能就不再起作用，要 重新研發(fā)新種或新血清型的愛德華氏菌減毒疫苗就需要在花費同樣的時間和代價，因此突 破愛德華氏菌滅活疫苗的技術(shù)具有重要的實用價值。 陽0化]經(jīng)過我們的研究發(fā)現(xiàn)，前人在愛德華氏菌滅活疫苗研究中遇到的失敗是因為未找 到能有效維持愛德華氏菌抗原的免疫保護力的滅活條件所致。而通過對福爾馬林作為滅活 劑的不同滅活強度下滅活效果的評估，構(gòu)建該滅活劑對愛德華氏菌的精確滅活模型，可實 現(xiàn)對愛德華氏菌的有效滅活，也可確定維持其抗原免疫保護力的精確變量，進而找到制作 可產(chǎn)生免疫力的愛德華氏菌滅活疫苗的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是建立福爾馬林作為滅活劑對愛德華氏菌的精確滅活模型，確定可 維持愛德華氏菌抗原免疫保護力的精確滅活方法，制備該病原具有免疫保護力的滅活疫 苗，W克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0007] 魚類作為較低等脊椎動物，具有產(chǎn)生獲得性免疫能力，因此通過免疫學(xué)技術(shù)來提 高魚體免疫力是一種可行的方法。不同的疫苗制備工藝會對抗原的免疫原性產(chǎn)生重要影 響，掌握具有可維持病原免疫原性的滅活方法直接關(guān)系到疫苗的應(yīng)用效果。
[0008] 本發(fā)明是W福爾馬林作為滅活劑對愛德華氏菌滅活來制備滅活疫苗，首先根據(jù)不 同滅活劑濃度（F)、滅活溫度（T)和滅活時間（A)對滅活效果的影響，建立滅活劑對愛德華 氏菌的精確滅活模型，再按照該模型來精確控制F、T和A=個參數(shù)，達到既使愛德華氏菌得 W安全滅活，又保持其抗原的免疫保護力的效果。
[0009] 精確滅活模型是一個由F、T和A構(gòu)成的曲面，在該曲面上選擇的點代表了=個參 數(shù)組合的取值，該取值能保證W愛德華氏菌的存活率負對數(shù)（p巧為代表的滅活強度被精 確控制到既能實現(xiàn)愛德華氏菌安全滅活，又能維持其抗原的免疫保護力的最低滅活強度。 最低滅活強度是指使愛德華氏菌得W完全滅活的最低滅活劑濃度、滅活溫度和滅活時間運 =種條件的優(yōu)化組合。
[0010] 精確滅活模型中F、T和AS個參數(shù)精確組合的曲面上的點，能保證pS為7. 5~ 8. 5,W達到既使愛德華氏菌得W安全滅活，又保持其抗原的免疫保護力的效果的目的。
[0011] 精確滅活模型的S個參數(shù)構(gòu)成的曲面，可W用數(shù)學(xué)關(guān)系式pS=kX(F+F0) axa+Wbx(A+A〇r來模擬，其中pS指愛德華氏菌存活率的負對數(shù)，F(xiàn)指滅活劑福爾馬林 的濃度（％ )，T指滅活溫度（°C)，A指滅活時間化），F(xiàn)0、TO和AO分別為F、T和A的初始 參數(shù)，取值范圍分別為0. 1 %~0. 3%、15~25和-5~5,a、b和C分別為F、T和A的權(quán)重 指數(shù)，取值范圍分別為0. 9~1. 1、1. 85~2. 05和0. 6~0. 7,k為S因子組合的綜合系數(shù)， 取值范圍為4. 5X10 3~5. 5X10 3。
[0012] 上述的福爾馬林作滅活愛德華氏菌的精確滅活模型的=個參數(shù)構(gòu)成的曲面，還可 W被其他連續(xù)或非連續(xù)的數(shù)學(xué)關(guān)系擬合表述或被矩陣或表格取值表述。
[0013] 本發(fā)明中上述的精確滅活模型中F、T和A=個參數(shù)的精確組合范圍是，體積百分 比濃度低于2 %的福爾馬林（37. 0% -40. 0%的甲醒溶液），在(TC- 100°C，滅活I(lǐng)Omin-48h，實現(xiàn)對愛德華氏菌的精確滅活，從而能用于制作愛德華氏菌滅活疫苗。
[0014] 所有上述應(yīng)用方式的目的都是要盡可能的維持抗原的免疫原性。所建立精確滅活 模型是掌握愛德華氏菌的精確滅活條件的依據(jù)，可為維持愛德華氏菌抗原免疫保護力的精 確滅活方法的確立提供技術(shù)標準。
[0015] 本發(fā)明證實采用不同劑量的同種滅活劑制備完全滅活疫苗的時間是不同的，兩者 的關(guān)系呈現(xiàn)負相關(guān)。經(jīng)上述最低滅活劑濃度、滅活溫度和滅活時間運=種條件的優(yōu)化組合 滅活處理的愛德華氏菌，經(jīng)將滅活劑去除，并能使100%的處理后的愛德華氏菌在膜腺大 豆肉湯（TSB)液體培養(yǎng)基中完全失去生長繁殖的能力，而且也無法在體內(nèi)恢復(fù)生長繁殖的 能力，則視為完全滅活。本發(fā)明也證實滅活條件對愛德華氏菌滅活疫苗的免疫原性有重要 影響，同種滅活劑的不同劑量處理也對滅活疫