一株普特拉鏈霉菌和衍生菌及其它們在防治植物真菌病害中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及農業微生物技術領域，具體地指一株普特拉鏈霉菌和衍生菌及其它們 在防治植物真菌病害中的應用。
【背景技術】
[0002] 放線菌可W產生豐富的次生代謝產物，目前發現的近萬種天然抗生素中約有=分 之二是放線菌產生的，而鏈霉菌又是放線菌中產生抗生素最多的一類微生物。一些鏈霉菌 產生的次生代謝產物對某些植物病原真菌的抱子萌發、菌絲生長和對植物的侵染具有顯著 的抑制作用，在植物病害防治中具有重要意義。其中一些鏈霉菌產生的次生代謝產物已進 行商業化生產，大規模應用于植物病害的防治中。例如由吸水鏈霉菌井岡變種發酵產生的 井岡霉素已成為我國防治水稻紋枯病最有效的殺菌素。
[0003] 但是，由于多數野生型鏈霉菌的次生代謝產物產量很低，次生代謝產物的純化難 度很大。通過誘變的方法（如紫外線誘變、氯化裡加紫外線復合誘變等）對野生型鏈霉菌 進行誘變改良可W大幅度提高鏈霉菌次生代謝產物的產量，降低鏈霉菌次生代謝產物純化 的難度。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題就是提供一株普特拉鏈霉菌和衍生菌及其它們在防 治植物真菌病害中的應用。 陽0化]為實現上述目的，本發明提供的一株普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I菌株，其保藏編號為：CCTCCNO:M2015515。普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis) F-I菌株與《鏈霉菌鑒定手冊》和《放線菌的分類和鑒定》中普特拉鏈霉菌（Streptomyces platensis)運一種群的相關特征描述相似。在此基礎上，通過分子水平上的16SrDNA鑒定 方法，PCR擴增得到其16SrDNA序列，將此序列在NCBI上進行BLAST同源比對和系統進化 樹分析，發現鏈霉菌F-I與普特拉鏈霉的同源性高達99. 93%。因此，將菌株F-I定名為普 特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I。
[0006] 該菌是從湖北武漢地區水稻植株上分離得到，該菌種已于2015年9月8日保藏于 中國典型培養物保藏中屯、（簡稱CCTCC);保藏登記號為CCTCCM2015515 ;保藏地點為：中 國、武漢、武漢大學。
[0007] 進一步地，所述普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I菌株置于葡萄糖馬 鈴馨瓊脂培養基PDA上培養一周，菌絲發達、氣生菌絲豐茂呈粉狀，無可溶性色素；菌絲彎 曲較多分枝，無橫隔膜，無斷裂。抱子絲波曲或螺旋狀，抱子呈卵圓形或短桿狀，表面光滑， 長1~3ym;該鏈霉菌F-I使淀粉水解，在纖維素上不生長，明膠液化微弱，牛奶腺化可凝 固，不產生&S。該菌能較好利用葡萄糖、麥芽糖、果糖和肌醇，可利用乳糖、甘油、甘露醇， 不利用薦糖和山梨醇。鏈霉菌F-I生長溫度范圍在10°C~40°C之間，最適宜生長溫度為 28°C~35°C。
[0008] 本發明提供了一株普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株，所述 普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株是由普特拉鏈霉菌（Str^tomyces platensis)F-l菌株經紫外光線光照突變得到，具體步驟如下：
[0009] 1)將普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-l菌株置于PDA斜面培養基上培 養兩周，向試管中加入適量無菌水，刮洗菌落表面的抱子，振蕩均勻，即為抱子懸浮液，其中 的抱子濃度為1〇7個抱子/mL;
[0010] 2)將鏈霉菌F-I抱子懸浮液置于瓦數為30~IOOW的紫外燈下光照5~135s，分 離篩選得到抑菌活性增強的菌株，并將其命名為普特拉鏈霉菌（Streptomycesplatensis) UV-46。
[0011] 本發明還提供了一株普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10菌株，其保藏 編號為：CCTCCNO:M2014361;所述普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10菌株是 將普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46置于氯化裡水溶液中，并經過紫外光線 光照突變得到；
[0012] 該菌種已于2015年7月28日保藏于中國典型培養物保藏中屯、（簡稱CCTCC);保 藏登記號為CCTCCNO:M2014361 ;保藏地點為：中國、武漢、武漢大學。 陽〇1引具體步驟如下：
[0014] 1)將普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株置于PDA斜面培養基上 培養兩周，向試管中加入適量無菌水，刮洗菌落表面的抱子，振蕩均勻，即為抱子懸浮液，其 中的抱子濃度為1〇7個抱子/mL;
[0015] 2)將鏈霉菌UV-46抱子懸浮液中添加氯化裡，抱子液中氯化裡的濃度分別 為0.3 %、0. 4 %，室溫下靜置4小時后置于瓦數為30~IOOW的紫外燈下光照5~ 135s，分離篩選得到抑菌活性最強的菌株，并將其命名為普特拉鏈霉菌（Streptomyces platensis)3-10。
[0016] 本發明還提供了一種普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-l、普特拉鏈霉 菌（Streptomycesplatensis)UV-46、普特拉鏈霉菌（Streptomycesplatensis)3-10 在制 備抗植物真菌病害生防制劑中的應用，其中，所述生防制劑的有效成分含有上述=種普特 拉鏈霉菌菌體中任意一種菌體在液體培養基中培養得到的液體培養物經過濾形成的濾液。
[0017] 進一步地，所述植物真菌病害為草替灰霉病和油菜菌核病。
[0018] 再進一步地，所述濾液的制備方法，包括W下步驟：
[0019] 1)從上述S種菌種普特拉鏈霉菌菌體中任意一種菌體接種在PDA斜面培養基上， 在溫度為28°C、光照條件下培養兩周，向試管中加入適量無菌水，刮洗菌落表面的抱子，振 蕩均勻，得到抱子懸浮液，其中，抱子懸浮液中，抱子濃度為1〇7個抱子/mL;
[0020] 。按體積百分比0. 1~0. 5 %將抱子液接種至PDB培養液中，在溫度28°C、20化/ min的條件下振蕩培養3d;得到培養物；
[0021] 3)將培養物離屯、，取離屯、上清液經濾紙過濾，得到的初級濾液經細菌過濾器再次 過濾，得到濾液。
[0022] 其中，PDB液體培養基的配方：馬鈴馨200g，葡萄糖20g，補充蒸饋水至1000ml。
[0023] PDB制作方法：將洗凈后去皮的馬鈴馨切片，加水1000 ml煮沸約半小時，用紗布濾 去馬鈴馨，然后加入葡萄糖20g，加水補足至1000ml，攬拌溶解后分裝滅菌。
[0024] 本發明的有益效果在于： |；0025] 1、本發明的普特拉鏈霉菌（Streptomycesplatensis)F-l、普特拉鏈霉菌 (Streptomycesplatensis)UV-46、普特拉鏈霉菌（Streptomycesplatensis)3-10 的液體 培養物濾液對灰葡萄抱菌菌絲生長、抱子萌發和采后草替灰霉病發生的抑制作用。
[0026] 2、本發明的普特拉鏈霉菌（Streptomycesplatensis)F-l、普特拉鏈霉菌 (Str巧tomycesplatensis)UV-46、普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis)3-10 的液體 培養物濾液對核盤菌菌絲生長、菌核萌發和核盤菌菌絲對小白菜葉片侵染的抑制作用。
【附圖說明】
[0027]圖1為鏈霉菌F-I菌落、抱子絲及抱子形態特征圖（PDA, 28°C，7d);圖中，A，菌落 正面；B，菌落背面；C，抱子絲；D，抱子鏈及抱子；
[0028] 圖2為紫外線照射時間與鏈霉菌F-I抱子死亡率的關系曲線；
[0029]圖3為氯化裡濃度梯度和紫外線照射時間與鏈霉菌UV-46抱子死亡率的關系曲 線；
[0030] 圖4為鏈霉菌F-1、UV-46、3-10的液體培養物濾液對灰霉菌菌絲生長的抑制作 用；
[0031] 圖5為普特拉鏈霉菌F-I及誘變得到的普特拉鏈霉菌菌株UV-46和3-10的液體 培養物濾液對灰葡萄抱菌抱子萌發的抑制作用；
[0032] 圖6為普特拉鏈霉菌F-I及誘變得到的普特拉鏈霉菌菌株UV-46和3-10的液體 培養物濾液對儲藏期草替灰霉病的防治效果；
[0033] 圖7為普特拉鏈霉菌F-I及誘變得到的普特拉鏈霉菌菌株UV-46和3-10的液體 培養物濾液對核盤菌菌絲生長的抑制作用；
[0034] 圖8為普特拉鏈霉菌F-I及誘變得到的普特拉鏈霉菌菌株UV-46和3-10的液體 培養物濾液對核盤菌菌核萌發的抑制作用；
[0035] 圖9為普特拉鏈霉菌F-I及誘變得到的普特拉鏈霉菌菌株UV-46和3-10的液體 培養物濾液對核盤菌侵染小白菜葉片的抑制作用；
[0036] 圖10為普特拉鏈霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10的液體培養物濾液的稀釋 液對核盤菌侵染小白菜葉片的抑制作用，
[0037] 圖中，10、50、100、500、1000為鏈霉菌培養物濾液的稀釋倍數。
【具體實施方式】
[0038] 為了更好地解釋本發明，W下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于W下實施例。
[0039] 實施例1普特拉鏈霉菌F-I的分離及鑒定
[0040] 一、菌株分離與篩選
[0041] 本發明的微生物是在湖北武漢地區水稻植株上分離到的一株具有較強括抗活性 的鏈霉菌。其分離方法為：將采回的水稻樣品根部用自來水沖洗干凈，去掉表面泥±。取 水稻的根、