一種煙曲霉生物膜流動模型的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體設及一種煙曲霉生物膜流動模型及流動裝置。
【背景技術】
[0002] 煙曲霉是一種常見的條件致病性真菌，其抱子體積微小，直徑2~3ym，漂浮于空 氣中，經呼吸道進入人體，肺部是曲霉感染主要發生部位。當宿主免疫力低下或者肺部的防 御機制下降時，可引起過敏性支氣管肺曲霉病（ABPA)、曲霉瘤或侵襲性曲霉病（IA)。而煙 曲霉感染中90 %為侵襲性感染，臨床表現缺乏特異性，死亡率高。近年的研究表明煙曲霉菌 可分泌大量胞外基質，在感染病灶中形成生物被膜，加重真菌的耐藥性。煙曲霉感染已經受 到眾多臨床工作者和科研者的關注。目前國外關于曲霉流動和靜止模型下生物被膜成膜能 力仍存在爭議，曲霉的研究模型尚無定論。而國內研究人員大多研究的是靜止模型的生物 膜形態及結構，相關的藥物干預亦是針對靜止模型狀態的生物膜形態和結構的研究，但靜 止模型的生物膜形態和生物體內的生物膜形態是存在差異的，生物體內由于血液的流動W 及其他因素的影響，因此在靜止模型下研究出的藥物，具體實施到生物體內，卻達不到預期 的效果。運已成為了限制煙曲霉生物膜及其相關的藥物干預研究的一大難題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是解決現有大多研究靜止模型的煙曲霉生物結構及形態，提供一種 更加接近于生命體內煙曲霉生物膜的形態和結構的研究模型，提供一種煙曲霉生物流動模 型。為實現本發明目的所使用的技術方案為： 一種煙曲霉生物膜流動模型，包括制備煙曲霉抱子懸液、建立生物膜流動模型和胞外 基質染色及化SM觀察生物膜形成； (1) 制備煙曲霉抱子懸液：將受試煙曲霉菌株在馬鈴馨葡萄糖瓊脂斜面培養基上， 35-37°C下活化3-5天，用含0. 025%Tween20的PBS緩沖液沖洗斜面收集抱子，用MCPS緩 沖后調pH值為6. 9-7. 1的RPMI-1640液體培養基重懸抱子，光學顯微鏡下用血細胞板計數 懸液中的抱子量，用上述RPMI-1640液體培養基將計數好的抱子懸液稀釋，調整抱子終濃 度為1-3X1Q5抱子/ml; (2) 建立生物膜流動模型：連接流動裝置，所述的流動裝置包括蠕動累，進液儲液瓶， 娃橡膠管，止水夾，單向排氣裝置，chamber,廢液收集瓶；蠕動累與進液儲液瓶通過娃橡膠 管連接，與進液儲液瓶的娃橡膠管即進液端，蠕動累與單向排氣裝置通過娃橡膠管連接，單 向排氣裝置和chamber通過娃橡膠管連接，距chamber兩端2-4cm處的娃橡膠管上各設置 一個止水夾，chamber和廢液收集瓶通過娃橡膠管，將連接好的流動裝置至于35-37°C恒 溫培養箱中，累0. 5%次氯酸鋼的儲液瓶消毒，隨后高速流通無菌雙蒸水清洗流動裝置，滅 菌清洗完畢后，連接累入RPMI-1640培養基，將配制備好的抱子懸液W300yL/channel從 chamber上游注入，夾閉兩端，倒置2-4小時后開通，菌體表面流速為0. 1-0. 5mm/s;培養 化、1化、24h、4化、7化后，行胞外基質染色，CLSM觀察生物被膜的形態； (3)胞外基質染色及化SM觀察生物膜形成：無菌生理鹽水緩慢清洗chamber中的生 物膜，無菌注射器注入300yL制備好的門TC-ConA染液，37 °C避光染色90分鐘，累無菌 去離子水洗去多余染液，然后置于化SM下觀察，激發光和濾過光的波長分別為488nm和 BF*515-530nm。
[0004] 優選地，將所述的流動裝置的置于35-37. 0 °C恒溫生化培養箱中，流動裝置進液 端管道入口置于含有150-200ml0.5%次氯酸鋼的儲液瓶中，出液端娃橡膠管開口置入廢 液收集瓶中，啟動蠕動累，調節累速為1. 5-2.化pm，持續4-化累入0. 5%次氯酸鋼消毒于 整個流動裝置；隨后將進液端娃橡膠管入口置入含1. 5-化滅菌雙蒸水的燒瓶中，W30-50 rpm累速高速流通無菌雙蒸水3-4h清洗流動裝置，同時開啟恒溫培養箱內的紫外射線消毒 燈消毒整個裝置外表面及其恒溫培養箱內部，直至滅菌清洗完畢； 將流動裝置進液端管娃橡膠管開口置入經MCPS緩沖后抑值為6. 9-7. 1的RPMI-1640 液體培養基的儲液瓶中，培養液溫度為35-37°C，調節蠕動累累速為3-5巧m，持續累入 5-lOmin，使RPMI-1640液體培養基充滿整個裝置管道；暫時停止蠕動累，于距chamber上 游2-2. 5cm處夾閉止水夾，用75%酒精消毒該段娃橡膠管，用1血滅菌注射器將步驟（1)中 配制備好的濃度為1-3XIO5抱子/ml的抱子懸液W300yL/channel的接種量，從該段管 道注入chamber,進液完畢后退出注射針頭，將chambe下游的娃橡膠管用止水夾夾閉，將 chamber倒置使其觀察面朝下，靜置2-4小時使抱子沉降并粘附于各chamber內各channel 的觀察面；抱子粘附完成后，將chamber轉置使各channel的觀察面朝上，再次開啟蠕動累， 調節累速為1. 75巧m，菌體表面流速為0. 2mm/s;于37. 0 °C恒溫培養化、1化、24h、4化、7化 后，停止蠕動累，對上述各個時點各個channel觀察面上形成的煙曲霉生物膜進行胞外基 質染色，激光共聚焦顯微鏡（CLSM)觀察生物被膜的形態。
[0005]W上所述的流動裝置還可W用75%乙醇進行消毒，消毒后，用轉速為50-lOOrmp的 無菌雙蒸水清洗。
[0006] 優選地，所述的步驟（2)抱子懸液在chamber倒置2小時后開通。
[0007] 優選地，所述的步驟（2)累流速為1.75rpm，菌體表面流速為0. 2mm/s。
[0008] 優選地，所述的步驟（3)胞外基質染色及化SM觀察生物膜形成：相應時間點培養 結束后，W1. 0-1. 5巧m累速緩慢累入滅菌PBS水漂洗chamber各channel內的已形成的煙 曲霉生物膜3-5min，于距chamber上游2-2. 5cm處夾閉止水夾，Iml注射器緩慢注入300JiL 制備好的門TC-ConA染液，注入完畢后夾閉chamber下游止水夾，將chamber倒置，于37°C 避光靜止染色90min后，向chamber內注入無菌去離子水洗去多余染液，將其觀察面朝上， 置于化SM下放大200倍觀察各channel中煙曲霉生物被膜的生長情況，激發光和濾過光的 波長分別為488nm和BP515-530nm。
[0009] W上所述的煙曲霉生物膜流動模型在煙曲霉生物膜研究中的應用。
[0010] 本發明的有益效果為：流動模型在體外生物膜研究是在蠕動累的幫助下將新鮮的 培養液隊直定流速輸送到微生物表面，維持穩定的抑、氧含量、液體剪切力，該模型具有無 破壞性、實時觀察等優點，可模擬植入導管相關感染的情況，是體外過渡到體內研究的研究 模型。
[0011] 流動模型的生物膜在發展過程中，煙曲霉粘附于載體并逐漸延長交叉纏繞成=維 立體結構，生物量、基質覆蓋率、平均厚度和平均擴散距離不斷增加，BF表面逐漸趨于平坦， 粗糖系數下降。而且本發明驗證了流動和靜止模型的區別對曲霉的粘附及萌芽時間并無影 響，而是對菌絲密度和ECM分泌量的影響。
【附圖說明】 陽01引圖1流動和靜止狀態下煙曲霉生物膜的生長情況；其中A1-A3分別表示流動模型 化、2地、7化的生物被膜3D形態；B-B3分別表示靜止模型化、2地、7化的生物被膜3D形態。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1建立煙曲霉生物膜流動模型和靜止模型 1、菌株 試驗菌株為臨床分離株，經本課題前期實驗研究鑒定為成膜能力最強的4號煙曲霉 困。
[0014] 2、載體 W直徑為13mm的圓形細胞爬片作為靜止模型的載體；W24X50mm材質相同的蓋玻片 作為流動模型的載體；高壓滅菌后使用。 陽〇1引 3、主要試劑 RPMI-1640粉（Gibco公司），MOPS(Sigma,USA)，氨氧化鋼(天津博迪化工股份有 限公司），馬鈴馨葡萄糖瓊脂（中國陸橋技術責任有限公司），F口C-ConA染液（vector 1油oratories,USA),憐酸鹽緩沖液（Gibco公司），次氯酸鋼溶液(天津大茂化學試劑廠)。
[0016] 4、主要儀器 24 孔細胞培養板（Corning,USA),蠕動累（WatsonMa;rlow205S，USA),FlowCell(Stovall,USA),生物潔凈安全柜（B肥-1300IIA/B2型，蘇州凈化設備有限公司凈公司），智 能生化培養箱（BS-2型，寧波江南儀器廠)，縱滿混合儀（XW-80A型，海口市其林貝爾儀器制 造有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（NIikonAl,日本)。
[0017] 5、方法 (1)煙曲霉抱子懸液的制備 所有受試曲霉在馬鈴馨葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化3-5天，用含0. 025%Tween20的PBS沖洗斜面收集抱子，用RPMI-1640培養基重懸抱子，血細胞板計數，并用在經MCPS緩沖 后調抑值為7. 0的RPMI-1640液體培養基稀釋，抱子終濃度為1-3X1〇5抱子/ml。
[0018] (2)靜止模型的制備 參照MowatE等，將圓形載體至于24孔板底部，加入Iml調整好的抱子懸液，37°C下分 別培養化、1化、2地、4化、7化，期間每24h更換培養液一次，用滅菌PBS輕柔漂洗載體3次， 行胞外基質染色，CLSM觀察生物被膜形態。
[0019] (3