大麥抗葉銹病蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，設及兩種與大麥抗葉誘病相關的蛋白及其編碼基因與 應用。
【背景技術】
[0002] 葉誘病是一種分布非常廣泛的麥類作物病害，世界上大多數小麥和大麥生產區 均有發現。在大麥生產中通常的年份大麥葉誘病可造成30%的減產，流行年份減產可達 60%。研究與實踐證明，利用抗病基因和培育抗病品種是防治作物葉誘病最經濟、安全、有 效和環保的措施。
[0003] 要應用抗病基因，首先先克隆抗病基因。近年來植物抗病基因的克隆方法隨著分 子生物學技術W及高通量測序技術的進步也不斷地在發展。目前植物抗病基因的克隆的 主要方法有圖位克隆技術，轉座子標簽技術，基因同源克隆技術，RNA水平的差異顯示技術 W及轉錄組測序技術等等。圖位克隆技術是一種非常有效的克隆抗病基因的方法，但是由 于需要大量的基因型及表型鑒定工作，因此它是一種非常耗時耗力的技術，尤其是對麥類 作物運種基因組龐大且復雜的植物。由于基因組龐大而復雜，且遺傳轉化效率較低等因素 的限制，轉座子標簽技術也同樣不適合麥類作物。而基因的同源克隆技術不能用來發現新 的抗病基因。基于RNA水平的基因差異表達技術在抗病基因的克隆和研究中發揮極大的作 用，例如可W運用cDNA-AFLP技術或者基因忍片技術分析接種病原微生物前后的基因表達 情況就可W找到接種前后有差異表達的抗病基因。隨著第二代測序技術的快速發展，RNA水 平的表達分析可W通過更為簡單的轉錄組和表達譜測序技術來實現。
[0004] 第二代測序技術相對于傳統的第一代測序技術具有測序速度快，數據量大，操作 流程自動化，成本成本低廉等優勢。目前代表技術有Illumina公司的Solexa技術，ABI公 司的SOLiD技術，Roche公司的454技術；能夠同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序。 [000引 Solexa測序技術最早使用Solexa公司研發，后被Illumina公司收購，其測序儀命 名為IlluminaGenomeAnalyzer。2010 年，GenomeAnalyzerIIx升級到HiSeq?2000,目 前已經升級到化Seq?2500。Solexa測序技術的核屯、原理是邊合成邊測序的方法（sequence bysynthesis,SB巧。Solexa測序技術最大的優勢是速度快，數據量大，成本相對低廉；但 是序列讀長較短。
[0006]Roche公司的Roche(454)GSFLX測序儀是在焦憐酸測序法（Hyman, 1988)基礎上 發展起來的。其原理是通過DNA合成時釋放的焦憐酸分子與反應體系中的ATP硫酸化酶反 應形成ATP;ATP再和巧光素酶共同氧化反應體系中的巧光素分子并發出巧光，進而判斷堿 基類型。基本流程包括：首先生成連有接頭的測序文庫；然后將DNA片段與水油包被的直徑 大約28ym的磁珠在一起解育、退火，emulsionPCR生成測序所需的模板；最后將磁珠顆粒 放置在PicoTite巧late(PT巧的小孔中，每個小孔僅能容下一個磁珠顆粒，再加入DNA聚合 酶和dNTP進行合成反應；采用焦憐酸測序法獲得序列信息。Roche(454)測序技術的優勢 是序列讀長長，可達4(K)bpW上；缺點是無法準確測量同聚物長度。
[0007]ABI公司的SOLiD(SequencingbyOligoLigationandDetection)測序儀義用 的是連接酶測序法（Pfeiferetal. 1989)。基本原理是首先通用引物和待測片段的接頭退 火，然后加入4種帶有不同巧光標記的8堿基半簡并寡聚核巧酸探針和連接酶；通過巧光檢 測連接上的探針種類；最后根據簡并引物中已知位置堿基的種類和循環數確定待測片段中 對應位置的堿基類型。其準確率最高可達99. 99 %，但是測序長度較短。
[0008]目前二代測序技術的發展極大的降低了轉錄組測序的成本，更開發出數字基因表 達譜值igitalGeneExpressingProfiling,DGE)測序技術來直接檢測基因表達的情況。 理論上DGE測序可W得到某一狀態下的所有轉錄本的表達情況，比基因忍片技術覆蓋的范 圍要大，成本也低于基因忍片技術。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的是提供與大麥抗葉誘病相關的蛋白及其編碼基因與應用。
[0010] 本發明所提供的蛋白質，為蛋白質A(命名為Rlrl蛋白）和/或蛋白質B(命名為 Rlr2蛋白）；
[0011] 所述蛋白質A(Rlrl蛋白）為下述al)或曰2):
[0012] al)氨基酸序列為序列表中序列1所不的蛋白質；
[0013]a2)將al)所限定的蛋白質的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與抗葉誘病相關的蛋白質；
[0014] 所述蛋白質B(Rlr2蛋白）為下述bl)或b2):
[0015]bl)氨基酸序列為序列表中序列2所示的蛋白質；
[0016]b2)將bl)所限定的蛋白質的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與抗葉誘病相關的蛋白質。
[0017] 為了便于蛋白的純化，可在由序列表中序列1或序列2的氨基酸殘基序列組成的 蛋白質的氨基末端或簇基末端連接上如下表所示的標簽。
[001引表：標簽的序列
[0021] 上述a2)和b2)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達 得到。上述曰2)和b2)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列3或序列4所示的DNA
[0019]
[0020] 序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0022] 當所述蛋白質為所述蛋白質A和所述蛋白質B時，其中所述蛋白質A和所述蛋白 質B可為任意比例，如摩爾比1:1。
[0023] 編碼所述蛋白質的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。
[0024] 所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可W 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[00巧]在本發明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質的基因。
[002引其中，編碼所述蛋白質A(Rlrl蛋白）的基因（命名為Rlrl基因）是如下1)至3) 中任一所述的DNA分子：
[0027] 1)序列表中序列3所示的DNA分子；
[002引2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質A的DNA分子；
[0029] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%W上同源性且所述蛋白質A的DNA分子；
[0030] 編碼權利要求1中的所述蛋白質B(Rlr2蛋白）的基因（命名為Rlr2基因）是如 下4)至6)中任一所述的DNA分子：
[003。4)序列表中序列4所示的DNA分子；
[003引5)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質B的DNA分子；
[003引6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%W上同源性且所述蛋白質B的DNA分子。
[0034] 上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0035] 其中，序列3由1263個核巧酸組成，第1-1263位為0RF，編碼序列表中序列1所示 的Rlrl蛋白。序列4由1458個核巧酸組成，第1-1458位為0RF，編碼序列表中序列2所示 的Rlr2蛋白。
[0036] 當所述基因為所述Rlrl基因和所述Rlr2基因時，其中所述Rlrl基因和所述Rlr2 基因可為任意比例，如摩爾比1:1。
[0037] 含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的 保護范圍。
[0038] 所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0039] 所述重組表達載體可用現有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元 農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、 PBI121、地inl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它參與mRNA加 工或基因表達的DNA片段。所述聚腺巧酸信號可引導聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核巧酸前可加上任何一種增強型、組成型、 組織特異型或誘導型啟動子，例如花挪菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、泛素基因化iquitin 啟動子（P化i)、脅迫誘導型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合 使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或 轉錄增強子，運些增強子區域可W是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的 來源是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區域可W來自轉錄起始區域或結 構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接W逆境 篩選轉化植株。
[0040] 在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述Rlrl基因轉錄的啟動子具 體為序列表中序列5 ;啟動所述Rlr2基因的轉錄的啟動子具體為序列表中序列6。
[0041] 更為具體的，所述重組表達載體為如下（a)或化）：
[0042] (a)在抑7GW2D(-p35巧載體的attRl和attR2之間插入序列表中序列7所示DNA 片段的重組質粒。
[0043] 化）在抑7GW2D(-p35巧載體的attRl和attR2之間插入序列表中序列8所示DNA 片段的重組質粒。
[0044] 所述表達盒由能夠啟動所述基因表達的啟動子，所述基因，W及轉錄終止序列組 成。
[0045] 所述蛋白質，或所述核酸分子，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌在如下任一 中的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0046] al)調控植物對葉誘病的抗性；
[0047] a2)選育抗葉誘病能力提高的植物品種。
[0048] 在本發明中，所述調控植物對葉誘病的抗性體現在：在所述植物體內，若所述 Rlrl蛋白和所述Rlr2蛋白的表達量越高，則所述植物對葉誘病的抗性越強。
[0049] 在本發明中，所述選育抗葉誘病能力提高的植物品種的方法，具體可包括將所述 Rlrl蛋白和所述Rlr2蛋白表達量較高的植株作為親本進行雜交的步驟。
[0050] 本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0051] 本發明所提供的培育轉基因植物的方法可為如下（A)或度）：
[0052] (A)培育抗葉誘病能力提高的轉基因植物的方法，具體可包括如下步驟：
[0053] a)向目的植物中導入所述Rlrl蛋白和所述Rlr2蛋白的編碼基因，得到表達所述 編碼基因的轉基因植物；
[0054] b)從步驟a)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比，抗葉誘病能力提高的 轉基因植物。
[005引 做培育抗葉誘病能力降低的轉基因植物的方法，包