組織結構體及其制作方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及由干細胞例如人工多能性干細胞、胚胎干細胞等未分化細胞發展成具有能夠匹敵成熟組織的功能的組織結構體及其制作方法。【
背景技術：
】[0002]近年來，進行了如下嘗試：使具有向各種功能細胞分化的能力的例如iPS細胞這樣的多能性干細胞分化成具有目標臟器或細胞所特有的功能的細胞，將其用于創新藥篩選、再生醫療（例如，非專利文獻1)。但是，這只不過是將體內（invivo)的功能的一部分得以再現而已，其功能與生物體內的功能相比較顯著地低。[0003]在創新藥篩選試驗中，要求表現出與在生物體內的試驗即所謂的invivo試驗同樣的藥物敏感性、毒性反應。為了在這樣的用途中應用，上述的現有技術是不充分的，正在尋求一種更成熟化的、即表現出與生物體內的細胞所具有的功能相匹敵水平的功能的細胞。[0004]雖然在再生醫療領域中進行著臟器移植、人工臟器移植，但卻存在有供體不足、排斥反應這樣的問題。例如，對于嚴重的臟器衰竭，在臨床現場進行臟器移植、利用人工臟器的置換治療。但是，對于臟器移植而言，存在有排斥反應、絕對的供體不足；對于人工臟器而言，只不過是僅將功能的一部分短時間替代而已，等等（例如，專利文獻1、2)，仍然存在著根本性的未解決問題。對于人為制造出人體組織而言，雖然可以考慮使用終末分化的細胞向單體（支架材料）進行細胞接種的方法等；但對于肝臟等具有復雜的高級功能的臟器，現狀是還不存在確立的方法（非專利文獻2)。[0005]這樣，雖然正在尋求最終分化的成熟細胞或生物體組織，但現狀是尚未實現。例如，對于肝功能，以下說明對成人體和現有的分化細胞進行比較的例。[0006]作為肝細胞的藥物代謝酶之一的細胞色素P450具有57種基因，由此可知細胞具有非常多的功能。通過它們同時起作用或者根據需要起作用而維持生命。[0007]另外，可以確認，肝細胞中甚至到達80的基因的表達量隨著從胎兒期至成為成人體而增加。進而，對于胰臟，非專利文獻3、4中示出了在生成過程中，隨著細胞成熟基因表達分布圖發生變化。[0008]現有技術文獻[0009]專利文獻[0010]專利文獻1:日本特開平9-56814號公報[0011]專利文獻2:日本特開2004-166717號公報[0012]專利文獻3:國際公開第2013/047639號[0013]專利文獻4:國際公開第2007/058105號[0014]專利文獻5:國際公開第2008/066199號[0015]非專利文獻[0016]非專利文獻1:MayaSchuldiner、等著〃Effectsofeightgrowthfactorsonthedifferentiationofcellsderivedfromhumanembryonicstemcells"、PNAS,97vol21、2000年10月10日（Publishedonline)、pp.11307-11312[0017]非專利文獻2:BasakEUygun、等著〃Organreengineeringthroughdevelopmentofatransplantablerecellularizedlivergraftusingdecellularizedlivermatrix'NatMed,16(7)，2010年6月13日（Publishedonline)、pp.814-820[0018]非專利文獻3:MartaSzabat、等著〃Kineticsandgenomicprofilingofadulthumanandmouseβ-cellmaturation"、Islets3:4、July/August2011、pp.175-187[0019]非專利文獻4:GuoqiangGu、等著〃Globalexpressionanalysisofgeneregulatorypathwaysduringendocrinepancreaticdevelopment^Researcharticle、2003年9月30日、pp.165-178[0020]非專利文獻5:FrancescoPampaloni、等著"Thethirddimensionbridgesthegapbetweencellcultureandlivetissue^NNaturereviewsmolecularcellbiologyvolume8、2007年10月、pp.839-845[0021]非專利文獻6:MarkusRimann、等著〃Synthetic3Dmulticellularsystemsfordrugdevelopment^CurrentOpinioninBiotechnology201223、2012年、pp.1_7【
發明內容】[0022]發明要解決的問題[0023]然而，雖然公開了例如：專利文獻3中記載的器官芽、專利文獻4中記載的由未分化細胞誘導胰島細胞的方法；專利文獻5中記載的由未分化細胞向胰島素分泌細胞的誘導方法等，但均是著眼于細胞功能中的一部分功能，對于個數有限的評價指標判斷分化的有無。因此，這樣的細胞、臟器不能判定為如上所述表達出多個基因模式的所謂的成熟水平。[0024]因此，使用通過現有的評價指標所判定的細胞、臟器來對藥物的作用效果、毒性等進行判定的情況下，產生不能正確地預測生物體內的反應這樣的問題、人工臟器不能充分地起作用這樣的問題。[0025]發明人等發現，為了回避上述的問題，重要的是全面地捕捉這些最終分化的成熟細胞或生物體組織的蛋白表達、基因模式。[0026]用于解決問題的方案[0027]我們發明了以最終分化的成熟細胞或生物體組織的蛋白表達、基因表達模式的相似性作為指標的新的組織結構體及其制作方法。[0028]本發明的一實施方式的組織結構體是通過與從血管細胞、間充質細胞、由血管細胞分泌的因子、由間充質細胞分泌的因子、由血管細胞與間充質細胞兩者存在而分泌的因子所組成的組中選擇的至少一種細胞和/或因子一起，將來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞進行共培養而得到的；對于多種功能使用皮爾遜積差相關系數（Pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient)測定出的值，所述組織結構體的該值相比于從胎兒采集的細胞或生物體組織更接近從成人體采集的細胞或生物體組織的值。[0029]另外，本發明的一實施方式的組織結構體優選的是，前述多種功能為10種以上的基因的表達量，前述10種以上的基因為前述組織結構體的基因表達量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的基因表達量改變2倍以上的基因。更優選的是，例如：基因表達量是使用全部基因片段被固定的DNA芯片而分析的值；前述10種以上的基因為前述組織結構體的基因表達量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的基因表達量改變2倍以上的全部基因。[0030]進而，本發明的一實施方式的組織結構體優選的是，前述多種功能為對10種以上的蛋白質測定的蛋白質量；前述10種以上的蛋白質為前述組織結構體的蛋白量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的蛋白質量改變20%以上的全部蛋白質。更優選的是，前述組織結構體為球狀體形狀，球狀體的直徑為50μm~2_。[0031]另外，前述多種功能優選為肝臟或胰臟所特有的功能。[0032]本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法是：（1)與從血管細胞、間充質細胞、由血管細胞分泌的因子、由間充質細胞分泌的因子、由血管細胞與間充質細胞兩者存在而分泌的因子所組成的組中選擇至少一種細胞和/或因子一起，將來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞進行共培養而制作培養形成物；(2)關于前述培養形成物所具有的多種功能，使用皮爾遜積差相關系數（Pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient)進行測定；（3)提取測定的值相比于從胎兒采集的細胞或生物體組織更接近從成人體采集的細胞或生物體組織的值的培養形成物作為組織結構體。[0033]另外，本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，優選的是，前述多種功能為10種以上的基因的表達量，前述10種以上的基因為前述組織結構體的基因表達量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的基因表達量改變2倍以上的基因；以及，前述組織結構體的提取是：測定前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞和前述培養形成物的基因表達量，選擇具有10種以上前述培養形成物的基因表達量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的基因表達量改變2倍以上的基因的培養形成物。更優選的是，例如：使用全部基因片段被固定的DNA芯片對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞與前述組織結構體的基因表達量進行分析時，前述10種以上的基因為組織結構體的基因表達量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的基因表達量改變2倍以上的全部基因。[0034]進而，本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，優選的是，前述多種功能為對于10種以上的蛋白質測定的蛋白質量，前述10種以上的蛋白質為組織結構體的蛋白量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的蛋白量改變20%以上的全部蛋白質；以及，前述組織結構體的提取是：測定前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞和前述培養形成物的蛋白質量，選擇具有10種以上前述培養形成物的蛋白質量相對于前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞的蛋白質量改變2倍以上的蛋白質的培養形成物。[0035]另外，本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，前述共培養的工序優選包括：形成聚集體的工序；形成器官芽的工序；進而進行培養使器官芽成熟化的工序。在此基礎上，在形成聚集體、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，優選細胞彼此結合而聚集；在形成聚集體、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，更優選細胞彼此結合而形成球狀體形狀的塊。[0036]本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，前述細胞彼此形成的球狀體的直徑優選為50μm~2_。前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞優選為從來自胎生干細胞或人工多能性干細胞中選擇的細胞，前述來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞更優選為能夠從來自人工多能性干細胞的細胞分化成內胚層系列的細胞的細胞。[0037]另外，前述多種功能優選為肝臟或胰臟所特有的功能。[0038]本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，優選用當量直徑為20μm以上且2.5mm以下、深度為20μm以上且1000μm以下的微容器培養前述組織結構體。在此基礎上，優選使用培養表面為細胞非粘接表面的培養容器培養前述組織結構體。進而在此基礎上，優選的是，前述培養容器的培養表面是與細胞接觸的培養面且涂布有聚合物，所述聚合物包含從磷脂、磷脂?高分子復合物、聚甲基丙烯酸2-羥乙酯（PHEMA)、聚乙烯醇、瓊脂糖、殼聚糖、聚乙二醇和白蛋白的組中選擇的一種或者它們的組合。[0039]本發明的一實施方式的組織結構體的制作方法中，優選的是，將血管細胞：來自干細胞的內胚層、外胚層或中胚層細胞：間充質細胞以10:7~10:1~2的比例進行共培養，并且以成為每1個微容器20個~2000個的密度接種細胞。另外，前述微容器是底部和開口部構成；前述開口部由包圍自其與前述底部的邊界至端部的區域的、錐角為1度以上且20度以下的壁構成；前述底部優選具有半球狀與圓錐臺的任一者的形狀。[0040]發明的效果[0041]根據一實施方式，能夠提供全面地捕捉最終分化的成熟細胞（由未分化細胞分化誘導的組織結構體）或生物體組織的蛋白表達、基因模式的組織結構體及其制作方法。【附圖說明】[0042]圖1是表不一實施方式的培養容器的一例的圖。[0043]圖2是表不從橫向觀察一實施方式的凹部的形狀例的截面圖。[0044]圖3是表示從上面觀察一實施方式的凹部的形當前第1頁1 2 3 4 5