指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術檢測領域，是一種指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢 測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]肉蓯蓉被稱為"沙漠人參"，具有極高的藥用價值，是廣泛使用的中國傳統的名貴 中藥材，早在1，800多年前的《神農本草經》就已有記載。肉蓯蓉味甘、性溫，具有補腎壯陽、 增強免疫、養血潤燥、延年益壽、保肝護肝等功效。肉蓯蓉藥食兩用，在歷史上就被西域各國 作為珍品上貢朝廷，也是歷代補腎壯陽類處方中使用頻度最高的補益藥物之一。肉蓯蓉的 宜食人群主要包括：體虛便秘、產后便秘、病后便秘及老年便秘者；患有男子遺精、早泄、陽 痿、精子稀少不育等病癥者；婦女帶下、不孕癥、四肢不溫、月經不調、腰膝酸痛等病癥患者 以及高血壓患者。忌食人群主要是經常大便溏薄者。
[0003]目前，家庭生活中，肉蓯蓉主要用于泡酒、泡茶、煮粥、燉湯等，國內外都有眾多的 肉蓯蓉制品投放市場，有肉蓯蓉優質飲片、提取物、配方顆粒、肉蓯蓉膠囊、茶包、速溶茶、肉 蓯蓉酒保健品等。近年來隨著人民生活水平的提高和人口老齡化，人們對保健品的需求量 也越來越大，因此肉蓯蓉的用量也逐年增大。但是在肉蓯蓉的生藥材市場中，其來源混亂， 主要藥用成分差異不明確，分級開發及應用還有待提高和加強。
[0004] 肉灰蓉的主要藥用成分為苯乙醇苷（Phenylethanoidglycosides,PhGs)類化合 物，隨著分離提取和檢測技術的飛速發展，至今已從肉蓯蓉肉質莖中分離出20多種類型的 苯乙醇苷，目前，對肉蓯蓉的質量評價主要是對其所含的松果菊苷和毛蕊花糖苷進行測定， 《中國藥典》2010年版肉蓯蓉項下也將上述兩個成分定為藥用價值指標。常用的測定方法 有薄層色譜（TLC)分析和高效液相色譜法（HPLC)等。但是，對于肉蓯蓉苯乙醇苷含量的 檢測，上述這些主要的檢測方法，都需要將采挖回來的肉蓯蓉，先進行至少半個月的晾干處 理，晾干后進行研磨，該過程耗時長，且實驗流程繁瑣、復雜。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是在生藥材采挖后提供一種簡單有效的快速指示肉蓯 蓉生藥材總苷含量范圍的方法；本發明還提供一種指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速 檢測試劑盒。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：采用實時熒光定量PCR法測 定肉蓯蓉生藥材中下述引物序列所擴增基因的表達值：
[0011] 其中基因SEQ2為與總苷含量呈正相關，基因SEQ1和基因SEQ3呈負相關；基因 SEQ4為內參基因。
[0012] 本發明包括下述步驟：
[0013] (1)RNA提取及cDNA反轉：提取待測肉蓯蓉的總RNA，RNA經純化后進行逆轉錄反 應；
[0014] (2)PCR擴增：對提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3進行RT-qPCR反應，SEQ4作為內 參基因；
[0015] (3)計算總苷含量:A、將生藥材分別將分為3個等級，右旗SGW~2. 5%、 G22. 5%~6. 8%和G36. 8%~14. 6%，左旗為GW~1. 2%、G21. 2%~2. 1%和G32. 1%~ 6.0% ；
[0016] B、根據PCR擴增得到的CT值，采用式（I)計算SEQ1、SEQ2和SEQ3三個基因的 ACT;記為分別與SEQ1、SEQ2、SEQ3對應的叫、n2、n3;
[0017] n.= 2 ACT= 2 (CT(所測基因）CT(內參基因）） (I)
[0018] 其中，T= 1、2、3,分別對應SEQ1、SEQ2、SEQ3 ;
[0019] C、將η!、n2、n3分別與Nu、Ni2、Ni3按照公式（Π)計算Pi;
[0021] 其中，i= 1、2、3,分別對應GpGpGy
[0022] 右旗中：Nn= 0· 04、N12= 3· 33、N13= 0· 38,N21= 0· 01、N22= 8· 02、N23= 0· 06， N21= 0、N32= 21. 33、N33= 0· 02 ;
[0023] 左旗中：Nn= 0· 02、N12= 1. 63、N13= 0· 01，N21= 0· 01、N22= 4. 50、N23= 0· 04， N21= 0、N32= 9. 64、N33= 0· 01 ;
[0024] D、比較ΡρP2、P3，總苷含量處于最小P#對應的Gi的范圍內。
[0025] 本發明所述步驟（2)PCR擴增的反應條件為：95°C、2min，95°C、15s，然后56°C、 30m，72°C、30s;共 40 個循環。
[0026] 本發明試劑盒包括RT-qPCR反應液和一組引物，這組引物包括1個正相關變化基 因SEQ2的正、反向引物，2個負相關變化基因SEQ1和SEQ3的正、反向引物，1個內參基因 SEQ4的正、反向引物。
[0027] 本發明試劑盒所述RT-qPCR反應液中包括RT-qPCR反應所需的試劑盒酶。
[0028] 實時熒光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)也稱為qPCR、 qRT-PCR，其基本原理是，在PCR反應體系中加入熒光基團，通過監測反應過程中熒光信號 的不斷累積來監測整個PCR過程，待反應結束后通過標準曲線對樣品中的底物模板DNA進 行定量分析。CT值是每個PCR管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環次數，起始 拷貝數越多，CT值越小。PCR體系中每種底物模板的CT值與該模板起始拷貝數的對數存在 線性關系。由于已知標準品的起始拷貝數，可據此作出標準曲線，只要獲得待測樣品的CT 值，就可以通過與標準曲線比較計算出該樣品的起始拷貝數。實時熒光定量PCR具有靈敏 度高、特異性強、檢測耗時少等優勢，整個過程可在2~3個小時內完成。采用該檢測系統， 結合我們已有的基因表達和肉蓯蓉總苷含量的關系表，即可計算轉換指示待測樣本的總苷 含量級別，是一種快速、有效并且操作簡單的方法，整個檢測過程可以縮短在一至兩天內高 通量實現。
[0029] 采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發明采用與肉蓯蓉總苷含量協同 變化的基因檢測，能達到對左旗和右旗肉蓯蓉生藥材的總苷含量進行快速指示并分級的效 果；只需提供極少量采挖出來的新鮮肉蓯蓉樣品，可在兩天內完成檢測，無需對新鮮生藥材 進行晾干，大大縮短了檢測周期。
[0030] 本發明采用二代測序技術及HPLC技術鑒定到三個和蓯蓉總苷含量協同變化的基 因，利用實時焚光定量PCR(Real_timequantitativePCR，RT-qPCR)即可快速指示生藥材 主要藥用成分含量范圍的快速檢測方法，為肉蓯蓉生藥材分級、高效的產品開發等應用提 供指導及標準參考；具有特異性強、靈敏度高、高效快速的特點。
【附圖說明】
[0031] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0032] 圖1是本發明右旗3個基因表達與總苷含量的協同變異圖；
[0033] 圖2是本發明左旗3個基因表達與總苷含量的協同變異圖；
[0034] 圖3是本發明協同變異正相關基因引物的特異擴增曲線圖；
[0035] 圖4是本發明協同變異負相關基因引物的特異擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0036] 本指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法及試劑盒的設計過程如下所 述：
[0037] 首先，確定與肉蓯蓉生藥材總苷含量協同變異的基因。分別采集來自內蒙古阿拉 善盟左旗和右旗兩個肉蓯蓉主產地的多份肉質莖材料，分別采用高通量測序獲得肉質莖的 轉錄本序列信息和基因表達信息，和采用高效液相色譜法（HPLC)測量獲得對應肉蓯蓉肉 質莖樣品的總苷（松果菊苷和毛蕊花糖苷）含量。通過轉錄本基因表達與總苷含量的協同 變化分析，確定3個與肉蓯蓉生藥材總苷含量協同變化的基因。基因SEQ2為與總苷含量呈 正相關，基因SEQ1和基因SEQ3呈負相關，結果見附圖1和附圖2 ;協同變異正相關基因引 物的特異擴增曲線見圖3,協同變異負相關基因引物的特異擴增曲線見圖4。
[0038] 其次，設計三套特異性強、靈敏度高、可高效快速檢測上述基因表達值的引物序 列；3個與肉蓯蓉生藥材總苷含量協同變異的基因的引物序列見表1，其中Left和Right分 別為正向引物序列和反向引物序列信息。
[0039] 表1:引物序列信息
[0040]
[0041] 最后，快速檢測試劑盒的構建及檢測方法的建立：本指示肉蓯蓉生藥材總苷含量 范圍的快速檢測試劑盒，包括RT-qPCR反應液和一組引物，這組引物包括1個正相關差異基 因（SEQ2)的正、反向引物，2個負相關差異基因（SEQ1和SEQ3)的正、反向引物，1個內參基 因（SEQ4)的正、反向引物；其中，RT-qPCR反應液還包括常規RT-qPCR反應所需的試劑盒 酶。
[0042] 本指示肉蓯蓉生藥材總苷含量范圍的快速檢測方法的具體檢測步驟如下所述：
[0043] (1)RNA提取：依照操作說明書使用TRIzol試劑盒提取肉蓯蓉的總RNA，實驗步驟 如下：
[0044] (A)先將研缽用液氮遇冷，每次取適量水稻葉片組織放入加有液氮的研缽中，充分 研磨組織塊（成粉末狀）。
[0045] (B)將研粹的粉末樣品轉入2mL離心管中，加入lmL的Trizol試劑懸浮，使其裂 解，再加入〇. 5ml的Trizol試劑懸浮，使其充分裂解，保存于-80°C或進行RNA提取。
[0046] (C)向上述離心管中加入300μL(l/5體積）氯仿，充分混勻（用力不要十分劇 烈），萃取去除雜蛋白，冰上靜置5分鐘。（注：禁用漩渦震蕩器，以免基因組DNA斷裂，造成 基因組DNA污染）
[0047] (D)4°C、13000轉/分鐘，離心15分鐘，此時溶液分為三層：下層的酚-氯仿，白 色渾濁的中間相多為變性蛋白，上層的是水相（RNA所在相），轉上清約900μL于另一干凈 2mL離心管中。
[0048] (E)向上清中加入等體積（約900μ1)氯仿，充分混勻，室溫靜置5分鐘。
[0049](F) 4°C、13000轉/分鐘，離心15分鐘，轉上清于另一干凈2mL離心管中。
[0050] (G)加入等體積異丙醇和2μL20mg/ml糖原，充分混勾，_80°C沉淀4小時以上或 沉淀過夜。
[0051](H) 4°C、14000轉/分鐘，離心30分鐘，棄上清，加入lmL的75%乙醇，洗滌沉淀， 4°C、14000轉/分鐘，離心5分鐘。
[0052] (I)棄上清，室溫晾干沉淀。
[0053] (J)加入適量體積（約20~50μL)RNasefree水溶解沉淀。
[0054] (K)應用瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，完整的RNA其28S亮度是18S的至少1 倍；
[0055] (L)檢測 0D值：純RNA樣品的 0D260/0D280 值為 1. 9 ~2. 1。
[0056] (2)RNA的純化：采用DNaseI(RNase-free)消化所得RNA樣本中的雜質，具體步 驟如下：
[0057] (A)所得RNA每 60μ1 中依次加入 10μ1 的lOXDNaselBuffer、2μ1 的RNase Inhibitor、2μ1 的DNasel、26μ1 的NF-Water，總體積為 100μ1 ;
[0058] (B) 37°C水浴 10min，洗滌沉淀